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Une analyse quantitative de divers modèles appliqués en microscopie à feuille de lumière en réseau
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Une analyse quantitative de divers modèles appliqués en microscopie à feuille de lumière en réseau

Jan 14, 2024

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4607 (2022) Citer cet article

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Les microscopes à feuille de lumière réduisent la phototoxicité et le bruit de fond et améliorent la vitesse d'imagerie par rapport aux microscopes à champ large et confocaux. Cependant, lorsqu'il est équipé de faisceaux gaussiens, le pouvoir de résolution axial d'un microscope à feuille de lumière et le champ de vision observable sont inversement liés. Des feuilles de lumière basées sur des réseaux optiques tramés améliorent la résolution axiale et l'uniformité du faisceau par rapport aux faisceaux gaussiens en utilisant des motifs d'éclairage structurés axialement. Cependant, ces avantages se font au détriment d'un éclairage total accru de l'échantillon et d'un confinement axial réduit du motif d'éclairage. À l'aide de simulations et de mesures expérimentales dans des cellules fixes et vivantes, nous quantifions les différences entre les nappes lumineuses gaussiennes et en réseau sur l'uniformité du faisceau, la résolution axiale, la résolution latérale et le photoblanchiment. Nous démontrons comment différents modèles d'éclairage de réseau optique peuvent être réglés pour donner la priorité à la résolution axiale ou à la section optique. Enfin, nous introduisons une approche pour fusionner spectralement des acquisitions séquentielles de différents motifs de feuille de lumière en réseau avec des propriétés optiques complémentaires pour obtenir des images à haute résolution et à faible arrière-plan.

Au cours des deux dernières décennies, la microscopie à feuille de lumière a été utilisée pour imager des échantillons biologiques à différentes échelles, allant de molécules simples à des organismes entiers1,2,3,4. La microscopie à feuille de lumière n'éclaire qu'un plan mince au niveau de l'échantillon. Cela minimise l'éclairage hors foyer, réduit le photoblanchiment et augmente le rapport signal sur bruit (SNR) par rapport à l'épifluorescence et à la microscopie confocale. De plus, en microscopie à fluorescence, la fonction d'étalement de point globale (PSF) est un produit à la fois des PSF d'excitation et de détection. Ainsi, si le motif d'éclairage est comparable ou plus fin que la profondeur de champ de détection, un éclairage à plan unique peut également améliorer la résolution axiale. Bien que les méthodes de balayage ponctuel comme le confocal augmentent également la résolution axiale et la section optique, l'éclairage plan avec détection à champ large permet une vitesse d'imagerie 100 à 1000 fois plus rapide avec un photoblanchiment considérablement réduit5.

Les implémentations les plus courantes de la microscopie à feuille de lumière utilisent des lentilles cylindriques pour focaliser un faisceau gaussien dans une feuille étendue latéralement avec un profil d'intensité axiale gaussien au niveau de l'échantillon. Cette approche se traduit par un compromis inhérent entre l'épaisseur de la nappe de lumière et sa longueur de propagation. Des feuilles de lumière gaussiennes plus fines offrent une résolution axiale et une section optique supérieures, mais au prix d'une longueur de propagation plus courte et d'un champ de vision plus petit. En revanche, des feuilles de lumière gaussiennes plus épaisses peuvent imager des zones plus grandes, mais ont une résolution et une section optique inférieures. Pour surmonter ces compromis, un certain nombre de groupes ont proposé d'utiliser des feuilles de lumière structurées pour l'éclairage, notamment des faisceaux de Bessel6,7, des faisceaux aérés8,9 et des réseaux optiques2,10 pour découpler la résolution axiale de la longueur de propagation du faisceau. En pratique, de tels faisceaux idéalisés, non diffractants, nécessiteraient une énergie infinie et ne pourraient pas être réalisés physiquement. Ce qui est généré à la place, ce sont des faisceaux hybrides de faisceaux gaussiens et non diffractants (par exemple, Bessel-Gauss ou treillis-Gauss) dans lesquels le motif d'éclairage est délimité par une enveloppe d'atténuation distribuée axialement pour confiner l'énergie d'éclairage autour d'un seul plan à le spécimen. Faire varier la largeur de l'enveloppe d'atténuation au niveau de l'échantillon ou de manière équivalente, répartir la distribution d'intensité de l'éclairage au plan focal arrière de l'objectif d'excitation le long de kz (qui est également la direction axiale de l'objectif de détection) permet à l'utilisateur d'ajuster le caractère du motif d'éclairage pour favoriser la longueur de propagation, la résolution axiale ou la coupe optique en fonction de l'échantillon biologique et des objectifs d'imagerie.

Deux articles récents11,12 ont étudié les propriétés des faisceaux non diffractants par rapport aux faisceaux gaussiens en utilisant à la fois des simulations11 et des mesures expérimentales12 (non biologiques). Étonnamment, ces articles ont suggéré que les réseaux optiques carrés (l'une des implémentations de feuilles de lumière en réseau les plus couramment utilisées) avaient des tailles de faisceau, des PSF et des fonctions de transfert optique (OTF) similaires aux faisceaux gaussiens et que les instruments utilisant des faisceaux gaussiens focalisés et des réseaux optiques carrés auraient fonctionnent indistinctement les uns des autres12. Comme ces résultats semblaient contredire les publications précédentes2 et nos propres expériences antérieures, nous avons cherché à enquêter sur la source de ces affirmations et à caractériser plus complètement les avantages et les compromis entre les faisceaux gaussiens et les nappes lumineuses en treillis. À cette fin, nous utilisons à la fois des simulations optiques et des mesures expérimentales sur des billes à diffraction limitée et une variété de structures cellulaires. Nous démontrons qu'en faisant varier l'enveloppe de délimitation au niveau de l'échantillon (étalement NA à la pupille d'entrée), les feuilles de lumière structurées peuvent être réglées pour se comporter davantage comme un réseau ou comme Gauss. Nous avons comparé des feuilles de lumière avec la même longueur de propagation et mesuré la PSF, l'OTF et effectué une corrélation de plan de Fourier (FPC)13 pour évaluer les corrélations de fréquence spatiale dans les images à plusieurs endroits le long de la longueur de propagation du faisceau. Nous démontrons que, par rapport aux faisceaux gaussiens, les nappes lumineuses à réseau carré et hexagonal ont (1) une résolution axiale plus élevée au foyer du faisceau et (2) maintiennent cette résolution plus élevée sur une plus grande partie de la propagation du faisceau. Dans les deux cas, ces avantages s'accompagnent du compromis d'une plus grande énergie dans les lobes secondaires qui flanquent le faisceau principal, ce qui entraîne une augmentation de la dose d'énergie totale à l'échantillon et une diminution de la section optique. À la lumière de cela, nous caractérisons les compromis en matière de résolution, de photoblanchiment et de phototoxicité pour les feuilles lumineuses gaussiennes, à réseau carré et à réseau hexagonal lors de l'imagerie d'échantillons fixes et vivants à des niveaux de protéines endogènes et faisons des suggestions sur la façon d'ajuster de manière optimale les paramètres de la feuille de lumière pour un échantillon biologique donné. Enfin, nous introduisons la fusion d'images à pondération spectrale comme approche pour combiner des images acquises à l'aide de nappes lumineuses avec des propriétés optiques complémentaires.

Nous commençons notre caractérisation en étudiant des nappes lumineuses de 20 μm de long optimisées pour l'imagerie des cellules adhérentes. Nous montrons la notation du système de coordonnées utilisé dans le reste de l'article sur la figure 1a. Nous définissons la longueur du faisceau par le demi-maximum pleine largeur (FWHM) du profil d'intensité le long de la direction de propagation y (Fig. 1b, c). Nous notons que d'autres métriques pour décrire la longueur de propagation telles que celles basées sur le sectionnement optique11 donnent également des résultats similaires (Tableau S1 et Fig. S1a). Pour quantifier la section optique de différentes feuilles de lumière, nous traçons également le profil axial d'excitation et l'intensité cumulée le long de la direction axiale au centre du faisceau et à la longueur de propagation FWHM (Fig. 1d, e). Pour commencer, nous avons comparé un faisceau gaussien de 0,21 NA, un réseau MB-carré avec NA = 0,35/0,25 (max et min NA respectivement) et un réseau hexagonal avec NA = 0,46/0,36. Pour les faisceaux gaussiens, il existe une relation unique entre le sigma, l'épaisseur du faisceau et la longueur de propagation14. Pour les faisceaux à treillis MB-carrés et hexagonaux, des faisceaux de même longueur de propagation, mais avec une structure différente peuvent être générés en ajustant la différence entre les NA min et max (∆NA), l'enveloppe d'atténuation imposée au plan de l'échantillon (∆kz à la pupille) et l'espacement du réseau de Bessel MB-carré (∆kx à la pupille). L'effet de ces paramètres pour chaque type de faisceau sera décrit dans la section suivante. Ici, nous avons gardé un ∆NA constant de 0,1 pour les faisceaux de réseau MB-carrés et hexagonaux et avons choisi un espacement de réseau MB-carré tel que les faisceaux latéraux soient juste à l'extérieur de l'anneau de délimitation interne, comme cela avait été fait précédemment2. Les réseaux MB-carrés et hexagonaux ont amélioré la résolution axiale par rapport à un faisceau gaussien de même longueur de propagation (Fig. 1f, h) tel que mesuré en comparant le FWHM axial PSF global (1,18λ pour le réseau hexagonal, 1,62λ pour MB-carré réseau, et 1,83λ pour Gaussien, Tableau S2). Ces différences sont devenues encore plus importantes lors de la comparaison des PSF globales loin du foyer du faisceau, par exemple au profil de propagation FWHM, qui dans cette situation est à 10 microns du foyer du faisceau (Fig. 1g, i). La FWHM axiale des PSF globales à cet emplacement était de 1,27λ pour le réseau hexagonal, de 1,6λ pour le réseau MB-carré et de 2,43λ pour le faisceau gaussien. Les tracés de l'épaisseur du lobe principal tels que définis dans les méthodes ont confirmé ces résultats, montrant que les valeurs d'épaisseur du lobe principal pour les nappes lumineuses à réseau MB-carré et hexagonal restent presque constantes sur toute la longueur de propagation du faisceau jusqu'à 22 λ tandis que l'épaisseur du lobe principal gaussien augmente de deux -replier sur cette plage (Fig. S1a). Nous avons également reproduit expérimentalement ces résultats pour chacun des faisceaux ici et démontré un très bon accord avec les simulations optiques (Fig. S2). Ensemble, ces résultats démontrent une différence clairement distinguable entre les nappes lumineuses gaussiennes, MB-carrées et hexagonales. Les nappes lumineuses à réseau MB-carré et hexagonal ont une résolution axiale plus élevée et maintiennent cette résolution sur une plus grande partie de la longueur de propagation que les faisceaux gaussiens. Comme dernier exemple, nous avons étudié des faisceaux supérieurs plats de même longueur qui sont générés en coupant une bande d'éclairage uniforme au niveau de la pupille avec un masque. Ces faisceaux produisent un champ électrique ressemblant à une fonction Sinc au niveau de l'échantillon avec des lobes latéraux d'intensité qui se situent entre ceux d'un faisceau gaussien et d'un réseau MB-carré. Les faisceaux à sommet plat affichaient des propriétés intermédiaires, montrant une résolution axiale similaire à la gaussienne au foyer du faisceau, mais moins de dégradation le long de la direction de propagation du faisceau. En contrepartie, les faisceaux à sommet plat avaient une résolution axiale inférieure, mais une meilleure section optique que les nappes lumineuses à treillis carré MB ou hexagonal à tous les emplacements (Fig. S3e et Tableau S2).

a Dessin schématique des objectifs de détection et d'excitation montrant les cadres de référence des coordonnées du plan de l'échantillon et de la pupille. b Profils de propagation yz simulés des trois faisceaux différents, 0 indique le foyer du faisceau et la ligne pointillée blanche indique la propagation FWHM, la position où l'intensité chute à 50 % du pic au foyer. c Ligne coupée à z = 0 le long de la direction de propagation en (b). d Profil de ligne le long de z pour le modèle d'excitation illustré en b au foyer du faisceau (y = 0, rangée du haut) et au demi-maximum pleine largeur (FWHM) le long de la propagation du faisceau (y = 24λ, rangée du bas). La PSF de détection à champ large est représentée par une ligne pointillée noire. e Profil d'énergie d'excitation cumulée sur l'axe z pour les trois faisceaux différents. Le tracé est calculé au foyer du faisceau (y = 0, rangée du haut) et au FWHM le long de la propagation du faisceau (y = 24λ, rangée du bas). f, g PSF globale pour les trois faisceaux différents au centre de propagation (y = 0) et au FWHM le long de la propagation du faisceau (y = 24λ). h, i Profil de ligne axiale pour la PSF globale illustrée en (f, g) le long de la ligne x = 0. h est lorsque le faisceau est focalisé le long de la direction de propagation, et i est lorsque le faisceau est au FWHM le long de la propagation direction.

Cependant, les améliorations de la résolution axiale pour le réseau carré MB, le réseau hexagonal et les nappes lumineuses à sommet plat se font toutes au prix d'un confinement réduit dans le profil z du faisceau d'excitation (Figs. 1e et S3b). Le tracé de l'intensité intégrée normalisée le long de la direction axiale à partir de z = 0 montre que l'énergie du faisceau gaussien est plus confinée par rapport aux autres types de nappes lumineuses testées. Celle-ci peut être quantifiée par la capacité de sectionnement optique, définie précédemment comme la demi-largeur à l'intérieur de laquelle se situent 63% de l'intensité cumulée11. La section optique pour le faisceau gaussien est de 0,84 λ contre 1,87 λ et 3,42 λ pour les réseaux MB-carrés et hexagonaux étudiés ici. Bien qu'à la coupure de 63%, la section optique du faisceau plat et gaussien soit similaire (Fig. S1a), les tracés des intensités cumulées du profil z des faisceaux plats et gaussiens démontrent un confinement réduit pour le faisceau plat à la fois le focalisation du faisceau et à la longueur de propagation FWHM (Fig. S3b), illustrant les défis liés au choix d'une coupure unique pour définir les valeurs d'épaisseur de feuille de lumière et de sectionnement optique. En ce qui concerne nos comparaisons de résolution, nos PSF d'excitation mesurées expérimentalement avec les trois mêmes faisceaux confirment ce compromis entre résolution axiale, invariance de propagation et confinement axial cohérent avec nos simulations (Fig. S2).

Enfin, les comparaisons en espace réel sont limitées dans leur capacité à décrire complètement la résolution. Par exemple, bien qu'elles soient intuitives, les mesures FWHM en espace réel sont dominées par un contenu à basse fréquence spatiale qui est efficacement transmis par le système. Ces comparaisons ne capturent pas clairement les changements dans la bande passante de fréquence spatiale observable du système et ne capturent pas non plus le contenu d'informations accru qui peut être observé à partir de l'échantillon et repondéré via la déconvolution. Ces caractéristiques peuvent être démontrées plus clairement dans l'espace des fréquences en comparant l'OTF du système. La comparaison des OTF pour les faisceaux gaussiens, les réseaux MB-carrés et hexagonaux a révélé une nette augmentation du support OTF axial pour les réseaux MB-carrés et hexagonaux sur les faisceaux gaussiens à la fois au foyer du faisceau et à la propagation FWHM (Fig. 2a – f). Pour ces comparaisons, les axes OTF sont tracés comme une fraction de 4π/λ qui est le double du vecteur d'onde. Pour une longueur d'onde donnée, le contenu fréquentiel spatial maximal réalisable par imagerie de fluorescence est défini par une sphère de rayon 4π/λ. Le traçage du rapport de l'amplitude de l'OTF pour les réseaux MB-carrés et hexagonaux par rapport au faisceau gaussien de longueur équivalente (Fig. 2b) révèle que sur une plage de fréquences axiales de 30% à 40% de 4π / λ, les nappes lumineuses du réseau ont 10- support jusqu'à 100 fois plus élevé qu'un faisceau gaussien de longueur équivalente. Ces différences sont encore plus importantes loin du foyer du faisceau (par exemple, à la FWHM du profil d'intensité le long de la direction de propagation y) (Fig. 2d).

a Images simulées à l'échelle logarithmique de l'amplitude OTF pour les trois faisceaux différents au foyer du faisceau (y = 0). b Images à l'échelle logarithmique du rapport d'amplitude entre l'OTF pour les nappes lumineuses à treillis MB-carré et hexagonal divisé par l'OTF du faisceau gaussien au foyer du faisceau (y = 0). c, d Tracés comparatifs à (a, b) au FWHM de la direction de propagation (y = 24λ). e, f Profils axiaux de l'amplitude OTF le long de la ligne kx = 0 (lignes rouges en a et c) au foyer du faisceau (y = 0) et à la propagation FWHM (y = 24λ).

Compte tenu des avantages évidents que nous constatons en termes de résolution et d'uniformité dans les réseaux MB-carrés et hexagonaux par rapport aux faisceaux gaussiens que nous avons observés dans nos simulations et nos ensembles de données expérimentales, nous avons cherché à comprendre pourquoi les publications précédentes12 n'étaient pas en mesure de détecter ces différences. Nous émettons l'hypothèse que cela pourrait être attribué soit au choix spécifique des paramètres utilisés pour définir et quantifier les faisceaux du réseau dans des études antérieures, soit à la configuration expérimentale spécifique utilisée pour les mesures. Comme indiqué ci-dessus, les faisceaux de réseau carré MB et de réseau hexagonal ont des paramètres supplémentaires qui peuvent être réglés de sorte qu'il est possible de générer des nappes de lumière avec des propriétés différentes qui ont toutes la même longueur de propagation. Par exemple, on peut augmenter (ou diminuer) le ∆NA de ces faisceaux. Cela équivaut à appliquer une enveloppe de délimitation d'atténuation plus étroite (ou plus large) à l'échantillon. En conséquence, les réseaux avec un ∆NA plus grand deviennent plus gaussiens tandis que ceux avec un ∆NA plus petit deviennent plus ressemblant à un réseau. Pour un ∆NA donné, des faisceaux d'une longueur donnée peuvent être obtenus en faisant varier le NA central autour duquel ce ∆NA est calculé. Les NA centrales inférieures conduisent à des faisceaux plus longs et les NA centrales supérieures conduisent à des faisceaux plus courts.

Nous démontrons cet effet dans les Fig. S4 et S5 pour des réseaux MB carrés et hexagonaux de 20 microns de long respectivement. En faisant varier ∆NA et la NA centrale ensemble, ces faisceaux de 20 microns passent de faisceaux de type plus gaussien avec une résolution axiale plus faible et un meilleur confinement axial, à des faisceaux de type réseau avec une résolution axiale et une uniformité plus élevées mais un confinement plus faible. Dans l'espace des fréquences, l'OTF globale est la convolution de l'OTF de détection à champ large avec l'OTF d'excitation. L'augmentation de la NA centrale du motif d'excitation entraîne des copies de l'OTF de détection à champ large qui sont décalées le long de l'axe kz permettant l'observation d'informations de fréquence spatiale plus élevée à partir de l'échantillon. L'augmentation de ∆NA étale ces copies décalées le long de l'axe kz pour remplir plus complètement l'espace de fréquence et augmenter la section optique. Nous notons que pour les réseaux MB-carrés avec un NA central élevé et un petit ∆NA, il est possible de décaler les ordres OTF étendus jusqu'à ce que l'OTF devienne dominé par le lobe central centré à kz = 0, ce qui provoque le faisceau en réel espace pour avoir l'air plus gaussien (Fig. S4). Pour les réseaux hexagonaux, les creux dans le support global de l'OTF dus à un petit ∆NA conduiront à des lobes latéraux plus grands dans le profil d'excitation et à un confinement axial moindre (Fig. S5).

Pour les réseaux MB-carrés, un paramètre de réglage supplémentaire est l'espacement du réseau multi-Bessel, qui détermine la position des deux faisceaux latéraux dans la pupille arrière. Bien qu'il s'agisse techniquement d'un paramètre libre, nous constatons que le faisceau le plus uniforme est obtenu en choisissant un espacement de faisceau tel que les deux faisceaux latéraux s'inscrivent dans l'anneau interne. Dans cette configuration particulière, les quatre faisceaux du réseau MB-carré partageront le même Δky, conduisant à la même longueur de propagation au niveau de l'échantillon, et donc à un profil d'excitation hautement cohérent le long de la direction de propagation. En fait, la variation de l'espacement du réseau multi-Bessel peut également entraîner un déplacement du support OTF d'une feuille de lumière plus gaussienne à une feuille de lumière plus semblable à un treillis. Comme le montre la figure S6, le déplacement des deux faisceaux latéraux vers l'intérieur de sorte qu'ils soient écrêtés par l'anneau interne du masque conduit à une feuille de lumière plus hexagonale avec une FWHM axiale réduite dans la PSF globale et une modulation accrue du profil d'excitation ( Fig. S6e, f, i–l), tandis que le déplacement des deux faisceaux latéraux vers l'extérieur conduit à une feuille de lumière plus gaussienne (Fig. S6g, h, i–l).

Ces variables pourraient expliquer pourquoi les publications précédentes étaient incapables de détecter une différence de performance entre les faisceaux gaussiens et les nappes lumineuses en réseau12. Nous émettons l'hypothèse que cela aurait pu être dû aux métriques de quantification spécifiques appliquées ou aux combinaisons spécifiques de NA central, ∆NA, espacement des réseaux choisis pour la comparaison. Alternativement, cet écart pourrait s'expliquer par les nuances de la configuration expérimentale utilisée pour l'étude en question dans laquelle l'enveloppe de délimitation pourrait être appliquée soit en recadrant le motif sur le SLM, soit en confinant l'éclairage en amont via des lentilles cylindriques qui peuvent avoir conduit à un treillis motifs qui étaient très gaussiens.

Compte tenu des compromis observés ici, nous avons choisi d'étudier plus avant les modèles avec un ∆NA de 0,1 pour les poutres en treillis MB-carré et hexagonal. Ces modèles offrent un choix intermédiaire entre l'augmentation de la résolution axiale et l'uniformité du faisceau sans trop sacrifier le confinement du faisceau. Cependant, nous notons que le choix du meilleur modèle dépendra de l'échantillon. Par exemple, des structures fluorescentes peu distribuées telles que des fosses recouvertes de clathrine, des condensats séparés en phase ou des microtubules peuvent tirer parti de la résolution axiale accrue offerte par des réseaux optiques moins confinés tout en ne souffrant pas excessivement d'une fluorescence floue. En revanche, des échantillons densément fluorescents comme l'actine, la GFP cytoplasmique ou la chromatine dense dans le noyau peuvent bénéficier de modèles d'éclairage plus confinés tout en sacrifiant la résolution axiale maximale atteignable. La possibilité de s'accorder entre les modèles qui couvrent ces caractéristiques est l'un des avantages de la microscopie à feuille de lumière en réseau.

Compte tenu des compromis en termes de résolution axiale, d'uniformité du faisceau et de sectionnement optique inhérents à chacun de ces faisceaux, nous avons cherché à mieux comprendre leurs performances à l'aide d'images simulées. Nous avons généré des images constituées d'émetteurs ponctuels multiples à une densité initiale de 3 émetteurs/μm3 et modélisé les effets du bruit de tir, de l'intensité de l'émetteur et de l'autofluorescence de l'échantillon (voir Méthodes). Des tranches de ces images dans le plan YZ sont affichées à la fois au foyer du faisceau et au FWHM de l'axe de propagation (Fig. 3a, b). Pour quantifier la résolution, nous avons utilisé FPC qui mesure la résolution via les corrélations entre les fréquences spatiales obtenues à partir de plusieurs observations indépendantes. Ceci est similaire à la corrélation en anneau de Fourier (FRC), sauf qu'il est capable de traiter l'anisotropie de résolution en imagerie 3D. En pratique, nous avons calculé les plans FPC en ky = 0 sur la base des images simulées 3D brutes (Fig. 3c, d). Dans ces mesures, une résolution plus élevée est mesurée comme une zone plus grande dans la région où le FPC reste au-dessus d'une valeur de coupure de 1/713,15. Comme illustré à la Fig. 3a, les images simulées montrent une tendance similaire à celle de nos simulations à une seule perle : du réseau gaussien au réseau MB-carré au réseau hexagonal, il y a une amélioration progressive de la résolution axiale et de la résolution globale, mesurée par le étendue axiale et surface intégrée totale du FPC au-dessus de la valeur seuil (Fig. 3c, e). De plus, pour les faisceaux de réseau MB-carrés et hexagonaux, la résolution montre peu de dégradation le long de la direction de propagation, tandis que pour les faisceaux gaussiens, la dégradation est plus importante (Fig. 3d, e). Comme prévu, le fond de l'éclairage hors foyer augmente également progressivement du réseau gaussien au réseau MB-carré aux faisceaux du réseau hexagonal. Le compromis de cet arrière-plan accru est une diminution mineure de la résolution latérale à mesure que nous progressons dans les différents types de faisceaux. Nous observons des tendances similaires lors de la simulation d'images avec une densité d'émetteur accrue (10 / μm3) (Fig. S7) ou un fond plus élevé (un rapport signal sur fond de 3) (Fig. 3f).

a, b Images de tranche xz brutes représentatives au foyer et à la propagation FWHM de chaque type de faisceau. c, d Images de corrélation de plan de Fourier (FPC) calculées sur la base de deux copies d'images simulées indépendamment en (a, b). Pour les images FPC des réseaux MB-carrés et hexagonaux, nous montrons le rapport de l'amplitude FPC par rapport à la gaussienne dans la plage de coupure de 1/7. e, f Zone FPC intégrée relative des images simulées à différents endroits le long de la direction de propagation. f Identique à (e) sauf calculé à un rapport signal sur fond inférieur (SBR = 3). Les zones FPC relatives sont calculées comme la surface totale dans les images FPC kx – kz avec une valeur supérieure à 1/7, puis normalisées par la zone FPC de Gaussian au centre de la propagation. g, h Richard-Lucy a déconvolué les images en (a, b).

Semblable à la microscopie à champ large, ce fond peut être éliminé par calcul via une déconvolution linéaire (par exemple, Wiener) ou itérative (par exemple, Richardson Lucy). La déconvolution lisse également l'OTF décroissante non monotone dans l'éclairage du réseau hexagonal, supprimant efficacement les contributions des lobes latéraux du motif d'excitation (Fig. 3g, h pour la déconvolution RL et Fig. S8 pour la déconvolution de Weiner). Ces résultats indiquent ensemble que malgré la diminution de la section optique, les images générées avec des motifs d'éclairage en réseau MB-carré et hexagonal peuvent capturer plus d'informations à partir de l'échantillon, ce qui se traduit par une résolution plus élevée et des images plus isotropes. En raison de l'uniformité accrue du faisceau, cette résolution accrue devient encore plus apparente lors de la comparaison au FWHM de la direction de propagation du faisceau et lorsque la fluorescence hors foyer est supprimée par calcul et que les fréquences spatiales OTF sont repondérées via la déconvolution. Cependant, nous avons remarqué que, alors que les nappes lumineuses à treillis MB-carré et hexagonal avaient toujours une résolution axiale plus élevée qu'un faisceau gaussien de longueur similaire, la résolution globale accrue des nappes lumineuses à treillis MB-carré et hexagonal dépendait du rapport signal sur bruit dans le simulé. image. Lors de la modélisation d'émetteurs avec une intensité inférieure de 100 points (et donc plus de bruit de tir) tout en conservant le même rapport signal sur fond (Fig. S9), les images de nappes lumineuses à treillis MB-carré et hexagonal avaient une résolution axiale plus élevée ; cependant, il n'y avait plus d'augmentation du signal FPC intégré par rapport aux faisceaux gaussiens (Fig. S9g). Cela implique qu'avec la diminution du rapport signal sur bruit, le sacrifice de résolution latérale dû à la section optique inférieure des réseaux carrés ou hexagonaux MB peut éventuellement dépasser le gain de résolution axiale lors du calcul de la zone FPC.

Pour vérifier si les conclusions tirées de nos simulations persistent dans les échantillons biologiques, nous avons ensuite imagé différentes structures subcellulaires avec les mêmes faisceaux mentionnés ci-dessus. Nous avons choisi d'imager la chromatine dans le noyau, les mitochondries et le cytosquelette d'actine, des caractéristiques qui couvrent un large éventail de morphologies et de densités au sein de la cellule. Pour assurer une comparaison équitable, nous avons réglé les intensités de sorte que chaque faisceau ait une intensité de pic égale au niveau de l'échantillon en mesurant le signal des billes fluorescentes comme décrit dans les méthodes. Sur la Fig. 4, nous montrons des tranches d'image YZ déconvoluées brutes et RL avec une région de zoom avant et un profil de coupe de ligne de filaments d'actine (Fig. 4a – e), de chromatine (Fig. 4f – j) et de mitochondries (Fig. . 4k–o) centré au foyer du faisceau. Dans les images expérimentales brutes, les compromis entre la résolution axiale et le confinement de la nappe de lumière restent valables : les images prises avec des faisceaux de réseau MB-carrés et hexagonaux ont une meilleure résolution axiale au prix d'un fond plus élevé (ces derniers peuvent à nouveau être quantifiés par FPC comme illustré dans les Fig. S10a–c). En plus de cet arrière-plan, les images brutes révèlent également la structure multilobée de l'éclairage de la nappe lumineuse à treillis hexagonal. Après déconvolution, les lobes de fond et latéraux sont fortement réduits (Fig. 4c, h, m). Dans l'ensemble, ces ensembles de données sont cohérents avec la conclusion tirée des images simulées et indiquent que les compromis entre les différents faisceaux persistent dans divers échantillons biologiques fixes.

un aperçu 3D des structures de filaments d'actine dans la cellule. Le contour orange montre la tranche de retour sur investissement utilisée pour (b, c). b, c Tranches YZ déconvoluées brutes et RL prises avec les trois faisceaux différents et une condition fusionnée MB-carré + hexagonale. La boîte englobante cyan est agrandie et illustrée à droite. d, e Profils d'intensité d'image pour chaque condition le long de la ligne pointillée rouge en b, les tracés d'intensité relative sont présentés en unités arbitraires (au). f–o Tracés comparables à (a–e) pour les images de chromatine et de mitochondries.

Nous avons remarqué que malgré une résolution axiale plus élevée dans les échantillons biologiques, la zone FPC intégrée dans les images de réseau MB-carré et hexagonal était plus petite par rapport à la gaussienne (Fig. S10d) en raison de la diminution de la résolution latérale à partir du fond élevé (ressemblant à l'observation en simulation multi-billes avec signal faible sur la Fig. S9). Ces observations montrent peu de dépendance à l'intensité des images acquises (cf Fig. S11 pour les images prises avec une puissance d'excitation quatre fois plus faible et donc un SNR plus faible) indiquant que pour ces deux conditions d'imagerie, l'augmentation du bruit de tir du signal hors foyer était résolution latérale compromettante.

Pour remédier à la perte de résolution latérale due à une section optique plus faible dans les modes d'éclairage du réseau, nous proposons ici de combiner les images de deux illuminations séquentielles de l'échantillon avec différentes nappes lumineuses aux propriétés complémentaires. Semblable à d'autres approches de fusion multi-vues qui visualisent l'échantillon sous plusieurs angles16,17, la fusion de feuilles multi-lumières avec des feuilles lumineuses conçues de manière appropriée peut remplir efficacement les creux dans l'espace OTF. Ces fusions combineraient alors la résolution axiale accrue et l'uniformité de propagation des nappes lumineuses à réseau MB-carré et hexagonal tout en évitant la diminution de la résolution due à l'augmentation du bruit de tir provenant d'une section optique inférieure. Dans notre approche, la fusion multi-vues se fait sans déconvolution et est effectuée dans l'espace des fréquences en calculant les sommes pondérées en fonction de la force OTF du réseau MB-carré et hexagonal (détails décrits dans Méthodes). Cette approche intègre efficacement le signal spectral sur bruit de chaque image et conduit à un OTF plus uniforme que la sommation d'image directe ou la sommation incohérente de plusieurs feuilles de lumière dans une seule exposition de caméra. Comme illustré sur la figure S12, la fusion pondérée spectralement des images de réseau carré et hexagonal MB a rempli les creux d'OTF dans le réseau hexagonal tout en conservant son extension OTF, conduisant à une PSF avec une FWHM axiale comparable mais des lobes latéraux réduits par rapport au réseau hexagonal. feuille de lumière utilisée ici. Lors de l'application de la fusion multi-vues à des images d'échantillons biologiques fixes, nous avons observé une résolution axiale comparable au réseau hexagonal mais moins de fond (Fig. 4), entraînant une augmentation globale du FPC (Fig. S10a – d).

Cependant, lors de l'imagerie de structures cellulaires plus compliquées, nous avons observé que dans certains cas, les images acquises avec un éclairage de réseau hexagonal montraient des structures spatiales inattendues qui étaient incompatibles avec une simple augmentation de la résolution axiale. Un exemple est illustré à la Fig. S13 où la surface inférieure du noyau apparaît décalée par rapport aux images déconvoluées prises avec un réseau MB-carré et des faisceaux gaussiens. Parce que nous avons montré dans des jeux de données simulés et expérimentaux que la déconvolution Wiener et itérative peut supprimer efficacement l'arrière-plan flou dans un éclairage hexagonal sans artefacts (Fig. S14), nous avons cherché à comprendre la cause de cet écart. Une hypothèse est que les artefacts sont dus à un désalignement entre les foyers de détection et d'excitation, comme cela serait causé par la nappe de lumière déviant lors du passage à travers des régions plus épaisses de l'échantillon biologique. Nos données simulées indiquent qu'un tel désalignement pourrait en effet entraîner un déplacement axial de la PSF globale et peut même provoquer des artefacts structurels multilobes si ce désalignement est particulièrement grave (Figs. S15 et S16). Pour tester si cela pouvait se produire dans nos images, nous avons mesuré expérimentalement le décalage relatif entre les plans focaux d'excitation et de détection en utilisant des billes fluorescentes sous les cellules (Fig. S17, les détails des mesures sont décrits dans Méthodes). La réfraction entre le noyau et le milieu de culture cellulaire peut entraîner un décalage axial aussi grand que 500 nm au fond de la cellule. Un décalage de cette ampleur modifierait la PSF globale et conduirait potentiellement à des artefacts dans l'image reconstruite. Ces mesures suggèrent que dans des circonstances où les décalages de feuille de lumière induits par l'échantillon sont négligeables, par exemple dans des échantillons minces, des échantillons optiquement effacés18, lors de l'utilisation de milieux de culture cellulaire à indice apparié19, ou lorsqu'ils sont combinés avec une optique adaptative pour corriger ces aberrations10, la lumière du réseau hexagonal des feuilles peuvent être appliquées pour améliorer la résolution axiale sans augmenter les artefacts des lobes latéraux. Cependant, des précautions doivent être prises pour les expériences où un désalignement important du faisceau induit par l'échantillon serait attendu.

Enfin, nous avons imagé des cellules IPSc vivantes qui ont été modifiées par le gène CRISPR-Cas9 pour exprimer des protéines marquées par fluorescence à des niveaux endogènes afin de quantifier les effets de photoblanchiment et de phototoxicité des trois feuilles de lumière différentes. À titre de comparaison, nous avons réglé les intensités de différentes feuilles de lumière pour avoir soit la même intensité de crête, soit la même intensité intégrée sur une enveloppe axiale de 10 μm. Nous avons testé à la fois des conditions d'imagerie à faible intensité (~0,033 μW/µm2 à l'échantillon et ∼60 photons pic de l'échantillon) et à haute intensité (∼0,1 μW/µm2 à l'échantillon et ∼240 photons pic à partir de l'échantillon) (détaillé résultats présentés dans la Fig. S18 et le Tableau S3). Nous avons imité de manière itérative des piles 3D de cellules IPSc vivantes exprimant l'α-tubuline-GFP pendant 700 s à une fréquence de 0, 14 Hz, et comme le montre la Fig. S19, même à l'intensité la plus élevée que nous avons testée, nous avons observé un photoblanchiment mais pas de phototoxicité significative dans l'un des trois types de faisceaux évalué par inspection visuelle des modifications de la dynamique des microtubules. Pour comparer le photoblanchiment, nous avons normalisé la somme des intensités de pixels dans chaque pile dans le laps de temps, tracé cela en fonction du temps et ajusté cette courbe avec une décroissance exponentielle (Fig. S20). La composante exponentielle décroissante est ensuite ajustée à ces données et tracée à la Fig. 5. Comme illustré, lors de l'imagerie avec la même intensité de crête, le faisceau gaussien a moins de photoblanchiment par rapport aux réseaux MB-carrés et hexagonaux (Fig. 5a, c), dans nos mesures de 100 volumes consécutifs, la fluorescence résiduelle de l'échantillon provenant de l'éclairage par faisceau gaussien tombe à 75 %, contre 69 % pour le réseau carré MB et 62 % pour le réseau hexagonal. Cela est probablement dû au confinement plus serré dans le profil d'excitation axial et à la diminution de la dose de lumière totale avec un éclairage gaussien (axe de droite sur les Fig. 5a, c). Dans la plupart des cas, les taux de photoblanchiment dépendent en grande partie de l'intensité intégrée, car les feuilles lumineuses avec la même intensité intégrée partagent des taux de photoblanchiment similaires (Fig. 5b). Cependant, cela semble dépendre de l'échantillon et de l'intensité, comme le montre la figure 5d, lorsque les microtubules sont éclairés avec des faisceaux de même intensité intégrée, le faisceau gaussien se photoblanchi beaucoup plus rapidement, probablement en raison de son intensité de pic instantanée plus élevée par rapport à MB-carré. et des réseaux hexagonaux avec la même dose totale (axe de droite sur la Fig. 5d).

a, b Constantes de décroissance exponentielle du photoblanchiment pour les cellules iPSC exprimant un marquage fluorescent avec de la tubuline α imagée par les trois faisceaux différents. Cinq cellules sont prises pour chaque condition. Les graphiques montrent la médiane (ligne rouge), les quantiles 25 et 75 % (boîte bleue), la plage de données (moustache) et les valeurs aberrantes (croix rouge). Les points verts sont tracés sur l'axe secondaire droit et indiquent l'intensité intégrée (ou maximale) relative par rapport au réseau MB-carré lorsque les trois faisceaux partagent la même intensité maximale (ou intégrée) relative. c, d Comparaisons de photoblanchiment similaires à (a, b), mais acquises avec des intensités d'éclairage plus élevées ((∼0,033 µW/µm2 à l'échantillon pour un SNR faible contre ∼0,1 µW/µm2 à l'échantillon pour un SNR élevé).

Dans cet article, nous avons effectué à la fois des simulations et des mesures expérimentales pour caractériser les compromis entre les différents modèles de faisceaux utilisés en microscopie à feuille de lumière. Nous évaluons les performances du faisceau à l'aide de comparaisons FWHM dans l'espace réel, de comparaisons OTF dans l'espace de fréquence et de FPC dans les deux images simulées à différentes densités d'émetteur et signal sur bruit, et lors de l'imagerie de diverses structures subcellulaires dans des cellules vivantes et fixes. Il est important de noter que nous effectuons ces mesures non seulement au foyer du faisceau, mais également à différents points le long de la longueur de propagation du faisceau. Dans tous les cas, nous démontrons une nette amélioration de la résolution axiale et de l'uniformité du faisceau le long de la direction de propagation pour le réseau carré MB et les réseaux hexagonaux par rapport aux faisceaux gaussiens ou à sommet plat. Dans un effort pour aider à résoudre les résultats contradictoires antérieurs, nous décrivons comment les différents modèles de réseau peuvent être optimisés pour différentes conditions d'imagerie en les ajustant pour qu'ils soient plus gaussiens ou de type réseau.

Le compromis pour ces avantages est que les réseaux MB-carrés, hexagonaux et les faisceaux à sommet plat ont une excitation hors plan accrue et une section optique réduite par rapport aux faisceaux gaussiens. Dans les échantillons densément fluorescents, cela se traduit par une augmentation du bruit de tir provenant d'un arrière-plan flou, ce qui entraîne une réduction de la résolution latérale et entraîne une augmentation du photoblanchiment chez les spécimens vivants. Pour résoudre ce problème, nous introduisons une méthode d'éclairage de feuille de lumière à fusion spectrale. En pondérant spectralement puis en additionnant deux images séquentielles prises avec des feuilles de lumière qui ont la même longueur et des propriétés optiques complémentaires, cette approche combine les avantages à la fois de l'éclairage du réseau carré MB à faible fond et de l'éclairage du réseau hexagonal à haute résolution axiale.

En imageant différentes structures cellulaires, nous démontrons que le photoblanchiment est complexe et peut dépendre non seulement de la dose totale, mais aussi de manière non linéaire de l'intensité instantanée ainsi que du microenvironnement chimique local au sein de la cellule. Pour les applications où la résolution et l'uniformité sont moins importantes que le photoblanchiment ou si l'utilisation de fluorophores moins stables est requise, un faisceau gaussien fournira la plus faible quantité d'éclairage à l'échantillon par rapport aux faisceaux à treillis plat, MB-carré ou hexagonal de même longueur de propagation et de même intensité de crête. Alternativement, si la résolution axiale et l'uniformité du faisceau sont importantes, alors, pour un faisceau d'une longueur donnée, des réseaux MB-carrés et hexagonaux, ou des images fusionnées des deux, captureront plus d'informations à haute résolution à partir de l'échantillon et résoudront des caractéristiques qui ne seraient pas visible avec un faisceau gaussien. Selon les exigences expérimentales, différentes feuilles de lumière en réseau peuvent être choisies pour équilibrer ces facteurs.

Toutes les comparaisons de résolution dans cet article, profils FWHM, mesures OTF et FPC, sont effectuées à partir des données brutes sans déconvolution. Pour toutes les feuilles de lumière comparées, ces images peuvent être traitées ultérieurement via une déconvolution linéaire (par exemple, Wiener) ou itérative (par exemple, Richardson-Lucy (RL)) pour corriger la réponse de l'instrument, y compris le profil de la feuille de lumière, et restaurer une image plus précise. estimation précise de la structure réelle de l'échantillon. Nous démontrons que la déconvolution linéaire et itérative est capable de supprimer le flou flou pour toutes les feuilles de lumière testées et, lorsqu'elle est utilisée avec le bon modèle PSF, peut restaurer avec précision des images sans artefact de l'échantillon. Cependant, nous vous recommandons vivement de ne pas utiliser d'images déconvoluées pour la comparaison de résolution quantitative. Un certain nombre de paramètres définis par l'utilisateur peuvent avoir un impact sur l'image restaurée et il n'est pas simple de régler ces paramètres de manière impartiale. Par exemple, on peut naïvement supposer que la fixation du nombre d'itérations dans la déconvolution RL permettrait une comparaison impartiale entre les conditions. Cependant, nous avons observé que la déconvolution RL converge à des vitesses différentes pour différents profils de feuille de lumière (Fig. S21a). Nous avons donc choisi de faire varier le nombre d'itérations pour chaque image de manière à obtenir une convergence constante dans toutes les conditions. Pour la déconvolution linéaire de Wiener, nous avons choisi de maintenir constant le paramètre de régularisation du rapport bruit/signal (NSR), bien que nous notions que la valeur optimale pour cela peut dépendre à la fois de la structure de l'échantillon, du nombre de photons et du profil de la feuille de lumière. En raison de ces préoccupations, nous n'avons utilisé que des données brutes pour des comparaisons quantitatives, démontrant ainsi que la déconvolution n'est pas nécessaire pour réaliser le gain de résolution de la microscopie à feuille de lumière en réseau.

De manière générale, nous vous déconseillons également d'utiliser uniquement des métriques de l'espace réel, telles que la communication du FWHM d'un émetteur ponctuel ou de l'épaisseur du lobe d'excitation principal pour caractériser la résolution. De telles caractérisations, bien qu'intuitives pour les faisceaux gaussiens, peuvent être très dépendantes du choix du seuil ou de la coupure pour les profils plus complexes (Fig. S22). À notre avis, une description complète de la résolution est mieux caractérisée dans l'espace des fréquences à la fois en étudiant l'OTF ou par des mesures objectives, compatibles avec des images d'échantillons biologiques, comme le FPC. En résumé, nous espérons que cette comparaison permettra aux futurs utilisateurs de choisir la meilleure feuille de lumière pour leur application biologique particulière. L'imagerie de spécimens biologiques est une tâche nuancée et difficile. Aucun outil d'observation expérimental n'est sans compromis, mais une discussion claire et équilibrée des compromis et des avantages des différents profils d'éclairage permettra à l'utilisateur de prendre une décision éclairée en fonction de ses objectifs expérimentaux.

Nous simulons le profil d'excitation de différentes nappes lumineuses au niveau de l'échantillon en définissant d'abord le champ électrique complexe au niveau de la pupille arrière de l'objectif d'excitation. Pour les nappes lumineuses gaussiennes et à sommet plat, ce champ électrique complexe est transformé par Fourier et mis au carré pour simuler le profil d'intensité au foyer de l'échantillon. Pour mieux se rapprocher du processus expérimental de formation de faisceaux de réseaux MB-carrés et de réseaux hexagonaux, nous avons introduit une étape intermédiaire dans laquelle le champ électrique complexe idéal sur la pupille arrière est transformé par Fourier pour simuler le champ électrique idéal au foyer de l'échantillon. Nous ne prenons ensuite que la composante réelle de ce champ idéal pour simuler l'effet du modulateur spatial de lumière (SLM) utilisé pour générer expérimentalement ces faisceaux (Fig. S23a). Étant donné que le profil de phase de champ électrique idéal au niveau de l'échantillon est nul ou Pi, cette approche est valable, que l'on utilise un SLM binaire ou à échelle de gris pour manipuler la phase du front d'onde réfléchi et générer expérimentalement des motifs de réseau. Cette image SLM est ensuite transformée de Fourier inverse (Fig. S23b) et filtrée par un masque annulaire avec une combinaison NA interne et externe souhaitée pour bloquer la composante DC et passer sélectivement le premier ordre de diffraction (Fig. S23c, d). Enfin, ce champ électrique complexe filtré est transformé de Fourier une dernière fois et mis au carré pour simuler le profil d'intensité au foyer de l'échantillon (Fig. S23f). Ces étapes consistent à simuler le trajet de la lumière dans le microscope à feuille de lumière en réseau où la feuille de lumière se réfléchit sur un SLM puis est filtrée par un masque au niveau d'un plan conjugué de pupille. De telles étapes sont contournées pour la simulation des feuilles de lumière gaussiennes car elles ne passent pas par le SLM et le masque. Pour simuler le profil d'excitation à différents endroits le long de la longueur de propagation du faisceau au niveau de l'échantillon, nous ajoutons un profil de phase de défocalisation complexe \({{{{{\rm{exp}}}}}}(2\pi{i}{k }_{y}\times{y})\) au champ pupillaire avant la transformation de Fourier en suivant les méthodes de Hanser et al., où y désigne la distance par rapport au foyer du faisceau, et \({k}_{y }=\sqrt{1-({{k}_{x}}^{2}+{{k}_{z}}^{2})}\), est la projection du vecteur d'onde à la pupille le long de la direction de propagation du faisceau20.

On définit un faisceau gaussien par un champ électrique à valeurs réelles avec un profil d'amplitude gaussien centré à l'origine et étalé le long de la ligne kx = 0 dans le plan pupillaire. Nous définissons l'ouverture numérique (NA) d'une feuille de lumière gaussienne comme la valeur à laquelle l'amplitude de la pupille chute à 1/e du pic gaussien central, avec son champ électrique à la pupille arrière suivant un profil de \({E}= {E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{(\frac{{k}_{z}}{{{{{{{\rm{NA }}}}}}}})}^{2})\). Nous définissons les faisceaux à sommet plat de la même manière comme un champ électrique à valeur réelle d'amplitude constante le long de la ligne kx = 0 avec une coupure NA à la pupille arrière (Fig. S24a). Les nappes lumineuses à réseau carré peuvent être générées soit comme le motif d'interférence d'un réseau cohérent de faisceaux de Bessel-Gauss avec un espacement défini sur l'axe des x au niveau du plan de l'échantillon, soit comme le motif d'interférence cohérent de quatre faisceaux centrés sur une NA donnée dans la pupille arrière et positionné à 0, 90, 180 et 270 degrés par rapport à la ligne kx = 0 (Fig. S24b). Des travaux antérieurs ont démontré que les réseaux MB-carrés sont équivalents à un sous-ensemble de possibles nappes lumineuses à réseau carré dans lequel chaque petit faisceau a un profil d'intensité constant le long de la direction kz2. Pour ce travail, nous avons simulé des réseaux MB-carrés en définissant d'abord le \(\Delta {{{{{{\rm{NA}}}}}}}\) du masque annulaire. Quatre petits faisceaux à valeurs réelles ont ensuite été générés dans la pupille arrière. Les faisceaux de 0 et 180 degrés étaient centrés latéralement sur la ligne kx = 0 et tandis que les faisceaux de 90 et 270 degrés étaient centrés axialement sur la ligne kz = 0. La position kx des faisceaux de 90 et 270 degrés sera déterminée par l'échantillon- l'espacement plan des faisceaux de Bessel cohérents ou peut être réglé directement dans le plan de la pupille. Sauf mention contraire et comme cela a été fait précédemment2, nous avons défini la position kx des faisceaux à 90 et 270 degrés juste à l'extérieur de l'anneau intérieur du masque. Chacun des quatre petits faisceaux a ensuite été étendu le long de la direction kz pour avoir une amplitude à valeur réelle constante qui a été coupée par la coupure du masque annulaire. Cette configuration particulière atteint une constante \({\varDelta k}_{y}=\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}^{2}\right)}-\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\max }}}}^ {2}\right)}\) sur la surface courbe de la pupille entre les quatre faisceaux. Dans cette condition, après la transformation de Fourier sur l'échantillon, le champ électrique apporté par les quatre faisceaux aura une longueur de propagation égale au niveau de l'échantillon, ce qui se traduira par le faisceau le plus invariant de propagation. Les réseaux hexagonaux sont générés en centrant six faisceaux à \({{{{{\rm{NA}}}}}}=\frac{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{ {\max }}}+{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}{2}\), où NAmax et NAmin sont les NA externe et interne au plan pupillaire. Le champ électrique de chaque point de la pupille est étendu à un profil gaussien, avec \(E=\,{E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{ (\frac{{k}_{z}}{\triangle {k}_{z}})}^{2})\). Où \({\triangle k}_{z}={{{{{\rm{FC}}}}}}\cdot \left({{{{{{\rm{NA}}}}}}} _{{{\max }}}-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}\right)\), et FC est le facteur de remplissage qui est mis à 1 dans notre simulation (Fig. S24c). Pour simuler le tramage expérimental afin de générer un profil d'éclairage homogène au niveau de l'échantillon, le profil d'intensité au niveau de l'échantillon est moyenné le long de la direction x pour générer la PSF d'excitation finale. La PSF de détection est simulée en suivant les intégrales de champ annulaire de Richards et Wolf avec NA = 1,0 et un indice de 1,3321, puis la PSF globale est calculée comme le produit pixel par pixel des PSF d'excitation et de détection. L'OTF globale est la transformée de Fourier de la PSF globale.

Pour caractériser nos PSF simulées, nous avons calculé leur demi-largeur maximale (FWHM) dans la PSF globale, leur plage de support OTF et leur sectionnement optique (tableau S2). Nous calculons l'éclairage FWHM à l'aide de la fonction "findpeaks" dans matlab (Mathworks) sur la base du profil axial global des PSF. Cette fonction définit la valeur semi-maximale à l'aide de la proéminence du pic, qui, pour les motifs à symétrie axiale utilisés ici, est définie comme 50 % de la valeur entre le pic central et la valeur d'éclairage minimale à ± 10λ (Fig. S22). La plage de support OTF est calculée comme la plage de fréquence où l'amplitude OTF chute à 0,1 % de la valeur DC, et la section optique est calculée sur la base de la demi-largeur dans laquelle 63 % de l'intensité cumulée tombe (comme Remacha et al. 11). Pour comparer notre caractérisation avec les résultats publiés précédemment, nous avons également suivi Remacha et al. et calculé la largeur du lobe principal dans le profil d'excitation, la section optique et la longueur de propagation sur la base de la section optique. Cependant, dans notre cas, nous avons défini la largeur du lobe principal comme la largeur où l'intensité chute à 63 % du pic. Notez qu'il s'agit d'un seuil différent de celui utilisé dans Remacha et al. (37%). Nous avons constaté que l'utilisation d'un seuil de 37 % entraînait une surestimation considérable de la largeur du pic axial central en raison des réseaux MB-carrés et hexagonaux dus aux lobes latéraux dans l'excitation (Fig. S22). En général, cet écart illustre les défis liés à l'utilisation d'un seul paramètre (par exemple, une intensité de coupure) pour définir des faisceaux non gaussiens, c'est pourquoi nous privilégions l'utilisation de métriques plus objectives comme la comparaison de l'OTF de chaque faisceau le long de la longueur de propagation. Enfin, nous comparons également la longueur de propagation du faisceau définie à l'aide de l'intensité FWHM, comme nous l'avons utilisé ici, et telle que définie à l'aide de la distance où la section optique double comme dans Remacha et al. et montrent que ceux-ci fournissent des estimations très similaires de la longueur du faisceau (tableau S1).

Nous avons simulé les conditions d'imagerie sur des volumes 3D de billes fluorescentes comme suit. Un volume 3D de points distribués de manière aléatoire à une densité définie est d'abord généré en tant qu'image de vérité au sol, puis convolué avec la PSF globale simulée (détection + excitation) à partir de différentes feuilles de lumière. Pour une image donnée, une seule PSF globale est utilisée pour convoluer tout le volume 3D sans tenir compte de la variation de PSF le long de la direction de propagation. Par conséquent, pour l'image simulée au centre de propagation du faisceau, la PSF globale au centre du faisceau est utilisée, et de même pour l'image simulée au FWHM de la propagation du faisceau. Pour simuler l'autofluorescence, un plancher de bruit gaussien constant est ajouté dans l'image de vérité terrain avant la convolution PSF. Pour modéliser avec précision le bruit de tir, un bruit de Poisson indépendant est ensuite ajouté sur chaque pixel de la PSF avant convolution et sur l'image simulée après convolution. Pour éviter d'introduire de fausses corrélations dans les images simulées, le bruit de Poisson est échantillonné indépendamment pour chaque image et paire PSF. Pour quantifier la résolution axiale et latérale, nous avons adopté FPC comme décrit dans Nieuwenhuizen et al.13 sur deux images 3D simulées générées avec la même vérité terrain et PSF chacune avec un bruit de Poisson indépendant. Dans le graphe FPC, le vecteur reliant chaque pixel à l'origine définit un plan dans l'espace de Fourier, sur lequel le coefficient de corrélation entre les deux images est affecté à l'intensité de ce pixel. Nous avons moyenné le plan FPC en kx = 0 et ky = 0, puis calculé la zone où la valeur FPC est supérieure à 1/7 comme quantification de la résolution globale de l'image.

Nous avons imagé des billes fluorescentes et des cellules fixes à température ambiante dans une solution saline tamponnée au phosphate (Corning, article # 46013CM). Nous avons imagé des cellules vivantes à 37 ° C degrés C dans 5% de CO2 dans Flurobrite (Thermo Fisher, A1896701) + sérum bovin fœtal (FBS, VWR : 1500-050) + pénicilline-streptomycine (Gibco 15140-122). Toutes les mesures ont été acquises sur une version modifiée de l'instrument décrit dans Chen et al.2 Les principales modifications pertinentes pour ce travail sont l'utilisation d'un SLM en niveaux de gris (Meadowlark P1920-0635-HDMI), une lentille d'excitation 0,6 NA (Thorlabs, TL20X- MPL), et une lentille de détection 1.0 NA (Zeiss, Objective W "Plan-Apochromat" × 20/1.0, model # 421452-9800) (Fig. 1a). Pour fournir une comparaison équilibrée, nous avons réglé l'intensité de toutes les nappes lumineuses en déplaçant axialement chaque motif d'excitation sur une plage axiale de 10 µm avec une taille de pas de 100 nm par rapport à une seule perle fluorescente rouge de 100 nm de diamètre (580 nm/excitation 605 nm/ longueur d'onde d'émission, Thermo Fisher, F8801). Sauf indication contraire, toutes les nappes de lumière ont été mises à l'échelle pour avoir la même intensité de pic au niveau de l'échantillon. Pour ce faire, nous avons mesuré l'intensité relative de la feuille de lumière en traçant l'émission intégrée de la perle à chaque position de la feuille de lumière, puis en ajustant les paramètres d'un filtre accordable acousto-optique pour obtenir soit la même intensité de crête, soit la même intensité intégrée (où indiqué ) pour chaque feuille de lumière différente. Pour estimer la puissance moyenne à l'échantillon pour chacune des différentes nappes lumineuses, nous avons divisé la puissance totale mesurée à la pupille d'entrée de l'objectif d'excitation par une zone déterminée par la largeur de la nappe lumineuse (w) et la hauteur axiale pour chaque faisceau dans lequel 90 % de l'énergie du faisceau était contenue (h90) (Fig. S18 et Tableau S3). Nous avons imagé des échantillons biologiques en balayant latéralement la platine de l'échantillon à travers la feuille de lumière avec une taille de pas de 200 nm (107 nm à chaque pas le long de la direction axiale de l'objectif de détection, étant donné qu'il existe un angle de 57,6 degrés entre le mouvement de la platine de l'échantillon et l'axe optique de l'objectif de détection, ou de manière équivalente, un angle de 32,4 degrés entre le plan d'imagerie de l'objectif de détection et le mouvement de la platine de l'échantillon). Pour l'analyse FPC, nous avons acquis deux images avec une exposition de 20 ms à chaque position avant de déplacer la scène. La même région d'intérêt a ensuite été imagée séquentiellement avec chaque type différent de feuille de lumière.

Pour les images simulées et biologiques, nous avons appliqué la déconvolution de Richard-Lucy avec la PSF globale mesurée expérimentalement correspondante pour chaque feuille de lumière. Étant donné que les piles d'images brutes prises expérimentalement sont faussées en raison de l'angle entre la détection et les coordonnées de l'échantillon, les images expérimentales brutes sont d'abord redressées avant d'être soustraites en arrière-plan à l'aide de la valeur moyenne du courant d'obscurité de la caméra. Après la soustraction du courant d'obscurité, les pixels négatifs sont coupés à zéro et la déconvolution RL est appliquée aux images redressées avec la fonction "deconvlucy" intégrée à Matlab (Mathworks). Pour compenser la différence de taux de convergence des différents modèles de feuille de lumière (Fig. S21a) et pour éviter d'augmenter le bruit dans les images en extrapolant au-delà du support OTF (Fig. S21b), nous avons appliqué de manière itérative la déconvolution RL jusqu'à ce que le carré moyen pixel par pixel différence entre les itérations voisines tombe en dessous de 25 % de la première itération. Ainsi, nous avons utilisé différents nombres d'itérations lors de la déconvolution des images pour différentes feuilles de lumière, mais nous nous sommes assurés que chaque condition finale atteignait le même degré de convergence. Pour la déconvolution de Wiener, nous avons appliqué la fonction intégrée Matlab "deconvwnr" avec NSR 0,005 pour toutes les conditions.

Nous avons cultivé des cellules COS7 exprimant un plasmide22 d'histone H2B-HaloTag intégré de manière stable (cadeau de Tim Brown au Janelia Research Campus, RRID:CVCL_0224) dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Gibco 11965-092) avec 10 % de FBS (VWR : 1500-050) et 1 % (v/v) 10 000 U/ml pénicilline-streptomycine (Gibco 15140-122). Nous avons obtenu des cellules iPSC (achetées à l'Institut Coriell pour la recherche médicale, RRID: CVCL_IR34) à partir des lignées cellulaires de la collection de cellules Allen (TUBA étiqueté mEGFP mono-allélique, AICS-0012) et les avons cultivées dans un milieu de base avec un supplément 5x fourni avec un ratio de 4:1 (STEMCELL Technologies 85850_c) et 1 % (v/v) 5000 U/ml pénicilline/sreptomycine (Gibco 15070-063). Pour l'imagerie cellulaire fixe, nous avons incubé COS7 avec 250 nM mitotracker orange (Thermo Fisher, M7510) dans un milieu de culture pour la coloration des mitochondries ou 250 nM JF549 dans un milieu de culture pour la coloration des histones pendant 30 min. Nous avons ensuite fixé les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (Electron Microscopy Sciences, 15710) et 8 nM/ml de saccharose (Sigma, S7903) dans du tampon cytosquelette (composé de 10 mM MES, 138 mM KCl, 3 mM MgCl et 2 mM EGTA) pendant 20 min à température ambiante. Pour la coloration à l'actine, nous avons perméabilisé les cellules dans 0,2 % de Triton-X (VWR Life Science, 0694) pendant 10 min, puis bloqué avec 2 % d'albumine de sérum bovin (Sigma, A9418) et 0,1 % de Triton-X pendant 10 min avant coloration avec de la phalloïdine 555 (Thermo Fisher, A34055) pendant 20 min.

La fusion multi-vues des images de différentes feuilles de lumière est effectuée dans l'espace des fréquences. Nous avons d'abord transformé les images de l'espace réel prises avec les feuilles de lumière à réseau carré et hexagonal MB en espace de fréquence et les avons normalisées par leur amplitude à DC. L'image de fusion multi-vues dans l'espace des fréquences est ensuite calculée comme la somme pondérée avec des poids déterminés par la force OTF relative de chaque motif : \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}} }}}}}=\,{\widetilde{I}}_{{{{{\rm{hex}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{\rm{hex }}}}}}}}{{O}_{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}} }}}+{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{MB}}}} }}}}{{O}_{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}}\ ), où \(\widetilde{I}\) indique la transformée de Fourier de l'image et O indique l'OTF. \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}}}}}}}\) est ensuite transformée de Fourier inverse dans l'espace réel pour générer l'image de fusion multi-vues. Nous avons constaté que cette fusion d'images pondérée en fréquence équilibre mieux le signal sur bruit à chaque composante de fréquence des différents modèles de feuille de lumière et se traduit par un OTF final plus lisse que la simple sommation d'image.

Pour mesurer la mesure dans laquelle une feuille de lumière est déviée lors de l'imagerie à travers des échantillons biologiques, nous avons cultivé des cellules COS7 sur du verre de couverture qui avait été pré-revêtu de billes fluorescentes rouges de 100 nm de diamètre, puis fixé et coloré avec de la phalloïdine Alexa 488. Pour mesurer le décalage de la feuille de lumière sous l'échantillon, à une position de scène donnée, nous avons d'abord balayé axialement le profil d'excitation par rapport au plan focal de détection et tracé le signal de fluorescence intégré à partir d'une petite région (3 pixels) autour de chaque perle dans le champ de voir. Le pic de ce tracé définit le centre du profil d'excitation par rapport à la position de chaque perle sous l'échantillon. Nous avons ensuite déterminé la position de chaque perle par rapport au plan focal de l'objectif de détection en balayant la lamelle avec l'éclairage de la feuille de lumière le long de l'axe optique de l'objectif de détection (équivalent à un éclairage à champ large). Le décalage du motif d'excitation par rapport au plan focal objectif de détection est ensuite calculé à partir de ces tracés en comparant les positions de la feuille de lumière par rapport au cordon et la position de la position du cordon par rapport au plan focal.

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Pour la comparaison des types de faisceaux sur des ensembles de données à cellules fixes, les expériences ont été répétées deux fois avec trois cellules dans chaque essai. Des images représentatives d'une seule cellule sont affichées ; toutes les cellules affichent la même tendance. Pour les tests de photoblanchiment et de phototoxicité des cellules vivantes, cinq cellules d'un seul essai ont été collectées. Toutes les cellules de l'essai affichent la même tendance. Les données agrégées sont tracées à la Fig. 5. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Les expériences n'étaient pas randomisées. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation pendant les expériences et l'évaluation des résultats.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les ensembles de données sous-jacents aux Figs. 1–3 peuvent être régénérés à partir du code source disponible comme décrit ci-dessous. En raison des limitations de taille, les ensembles de données sous-jacents aux Figs. 4 et 5 et toutes les figures supplémentaires (à l'exclusion de celles qui peuvent être générées à partir du code source) sont disponibles gratuitement auprès de l'auteur correspondant sur demande. Dans la mesure du possible, les auteurs essaieront de répondre à toutes les demandes de partage de données dans les 2 semaines suivant la demande initiale. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code source généré pendant et/ou analysé pendant l'étude en cours est disponible sur : https://github.com/legantlab/Shi_et_al_Nat_Comm_SourceCode. Le code est fourni sous la licence MIT pour les logiciels open source, une licence permissive approuvée par l'Open Source Initiative. Les termes spécifiques peuvent être trouvés ici : https://opensource.org/licenses/MIT.

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Nous remercions le Dr Eric Betzig pour des discussions utiles et pour avoir fourni une partie du code utilisé pour les simulations optiques. Nous remercions également le Dr Daniel Milkie pour son aide avec le logiciel de contrôle pour exécuter le microscope à feuille de lumière en treillis dans ce travail. Ce travail a été financé en partie par des subventions des National Institutes of Health (1DP2GM136653) accordées à WRLWRL reconnaît le soutien supplémentaire du programme Searle Scholars, du programme Beckman Young Investigator et de la bourse Packard pour la science et l'ingénierie.

Département commun de génie biomédical, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Université d'État de Caroline du Nord, Chapel Hill, Caroline du Nord, 27599, États-Unis

Vous Shi et Wesley R. Legant

Département de pharmacologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, 27599, États-Unis

Timothy A. Daugird et Wesley R. Legant

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YS et WRL ont conçu le projet et conçu les études. YS a réalisé les simulations, les mesures expérimentales et l'analyse des données. YS et TAD ont préparé des échantillons utilisés pour des mesures expérimentales. YS et WRL ont rédigé le manuscrit avec les commentaires de tous les auteurs. WRL a supervisé et dirigé le projet.

Correspondance avec Wesley R. Legant.

WRL est l'auteur de brevets liés à Lattice Light Sheet Microscopy et à ses applications, notamment : Numéros de brevets américains : US 11 221 476 B2 et US 10 795 144 B2 délivrés à WRL et à ses coauteurs et attribués à l'Institut médical Howard Hughes. YS et TAD ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Shi, Y., Daugird, TA et Legant, WR Une analyse quantitative de divers modèles appliqués à la microscopie à feuille de lumière en réseau. Nat Commun 13, 4607 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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Reçu : 18 mai 2022

Accepté : 26 juillet 2022

Publié: 08 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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