SB2301

Communications Biology volume 6, Article number: 300 (2023) Citer cet article

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Les gouttelettes lipidiques (LD) sont impliquées dans divers événements biologiques dans les cellules, ainsi que leur rôle principal en tant que centre de stockage des lipides neutres. L'accumulation excessive de LD est fortement corrélée à diverses maladies, y compris les maladies métaboliques. Par conséquent, une compréhension de base du mécanisme moléculaire de la dégradation du LD serait bénéfique à la fois pour la recherche universitaire et industrielle. La lipophagie, un mécanisme sélectif d'autophagie/processus de dégradation de la LD, a suscité une attention accrue dans la communauté des chercheurs. Ici, nous avons cherché à élucider un nouveau mécanisme de lipophagie en utilisant la petite molécule dégradant LD, SB2301, qui active la lipophagie médiée par l'ubiquitine. À l'aide d'une méthode d'identification de cible sans étiquette, nous avons révélé que l'éthanolamine-phosphate cytidylyltransférase 2 (PCYT2) est une protéine cible potentielle de SB2301. Nous avons également démontré que bien que SB2301 ne module pas la fonction PCYT2, il induit la translocation cellulaire de PCYT2 vers la surface LD et augmente spatialement le rapport phosphatidyléthanolamine (PE)/phosphatidylcholine (PC) de la membrane LD, provoquant la coalescence LD, conduisant à l'activation du processus de lipophagie pour maintenir l'homéostasie énergétique.

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites spécialisées qui stockent les acides gras libres cellulaires (FFA) sous forme de lipides neutres, tels que le triacylglycérol (TG) ou les esters de stérol (SE), pour éviter la lipotoxicité des FFA1,2. Dans les LD, les lipides neutres sont entourés de phospholipides tels que la phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE)3, et de protéines de surface telles que la famille des périlipines4 et les lipases5. Les cellules génèrent ou dégradent dynamiquement les DL en réponse aux changements environnementaux pour maintenir l'homéostasie énergétique et réguler le métabolisme des lipides6.

Les lipases à la surface du LD dégradent principalement les lipides neutres lorsque les cellules nécessitent une dégradation du LD7,8. Singh et al. ont rapporté que les LD pourraient être un substrat de l'autophagie sélective, appelée lipophagie, qui séquestre les LD dans les autophagosomes dans des conditions de famine9. La communauté de la recherche biomédicale a travaillé sur le mécanisme de la lipophagie pour révéler divers rôles des LD au-delà du stockage des lipides neutres10, tels que la modulation du stress cellulaire11,12, la régulation fonctionnelle des protéines13,14 et le stockage d'autres biomolécules15,16. Par conséquent, l'étude du mécanisme de régulation de la LD peut fournir des informations précieuses pour définir les voies biologiques sous-jacentes en raison de sa pertinence dans les domaines de la biologie chimique et de la découverte de médicaments. De plus, la pertinence physiologique des LD dans les maladies métaboliques a récemment été soulignée. L'accumulation de LD dans les muscles et le foie est une caractéristique des maladies métaboliques, notamment la stéatose17,18, le diabète de type 219,20 et l'athérosclérose21,22. Ainsi, la lipophagie est apparue comme une nouvelle stratégie pour traiter ces maladies, en particulier la stéatose et les maladies du foie23,24,25.

De plus, l'approche basée sur le phénotype a été une stratégie majeure pour découvrir de nouvelles entités moléculaires avec de nouveaux modes d'action. Dans cette étude, nous avons effectué un criblage à haut débit basé sur l'image pour surveiller le nombre et la taille des DL cellulaires en tant que phénotypes cruciaux dans les cellules vivantes. Nous avons en outre évalué une nouvelle petite molécule, SB2301, pour explorer la lipophagie médiée par l'ubiquitine en tant que nouveau mécanisme de régulation des LD. À l'aide de SB2301, nous avons révélé un nouveau mécanisme d'activation de la lipophagie qui induit la dégradation du LD en modifiant spatialement la composition lipidique des membranes du LD.

Tout d'abord, nous avons effectué un criblage phénotypique basé sur l'image des LD cellulaires dans des cellules vivantes pour identifier les modulateurs potentiels des LD cellulaires. Auparavant, nous avons signalé la sonde fluorogène, SF44, qui a une propriété d'activation sélective LD hydrophobe dans les cellules vivantes26. Nous avons également démontré l'application du SF44 à l'imagerie de fluorescence à haut débit avec un excellent facteur Z'27. Le système de surveillance LD basé sur SF44 utilisant SF44 permet une observation en temps réel de la dynamique LD cellulaire sans avoir besoin d'étapes de lavage. Ainsi, nous avons appliqué ce système de surveillance LD à haute teneur dans des cellules vivantes pour identifier de nouvelles entités chimiques dépourvues de toxicité cellulaire avec une influence minimale d'autres facteurs externes.

Nous avons précédemment rapporté une série de composés qui réduisaient les LD cellulaires28. Ces composés ont été dérivés d'une bibliothèque privilégiée de synthèse orientée vers la diversité (pDOS) basée sur la sous-structure conçue avec une fraction isoxazole centrale et sa substitution aux positions C3 et C5 par des structures privilégiées, telles que l'indole, le benzopyrane, la quinoléine et la pyrimidine (Fig. . 1). Parmi eux, seuls les dérivés d'isoxazole substitués par le 3-(quinolin-6-yl)phénol ont montré une excellente efficacité pour la réduction de la LD cellulaire. Cependant, ces composés ont montré un certain degré de cytotoxicité. Pour résoudre ce problème, nous avons remplacé bioisostériquement l'isoxazole par le 1,2,3-triazole en tant que modification structurelle pour éviter la cytotoxicité tout en améliorant les activités de réduction de LD souhaitées29. Avec des isoxazoles substitués par du 3-(quinolin-6-yl)phénol comme point de départ, nous avons construit une bibliothèque de 1,2,3-triazoles 1,4-disubstitués contenant des structures privilégiées par la quinoléine pour des études de relation structure-activité (SAR) ( Note complémentaire 1). Une série de 17 analogues a été conçue et synthétisée à partir d'échafaudages de 3-(quinolin-6-yl)phénol et de 1,2,3-triazole (Note complémentaire 2). Comme le montre le schéma supplémentaire 1, l'alcynylquinoléine a été soumise à une réaction de clic catalysée par le cuivre (I) avec divers azotures aromatiques en présence de CuSO4·H2O et d'ascorbate de sodium.

L'activité de réduction de la LD de ces analogues (1 à 20) a été initialement évaluée dans des cellules HeLa de cancer du col de l'utérus humain à une concentration fixe (10 μM chacune) pour déterminer l'efficacité de la réduction de la LD. De plus, la puissance a été déterminée en mesurant la concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) (tableau supplémentaire 1). Les composés à haute cytotoxicité et faible solubilité dans l'eau ont été exclus lors du criblage phénotypique à haute teneur. Sur la base de notre étude SAR, nous avons confirmé que le 1-(2-trifluorométhyl phényl)-4-(3-hydroxyphényl quinolone)triazole (4) présentait l'activité de réduction de LD la plus puissante parmi nos dérivés et a été nommé SB2301 (Fig. 1A) . Nous avons observé une activité de réduction de la LD dose-dépendante dans les cellules HeLa avec une IC50 de 4, 4 μM à 24 h après le traitement avec SB2301 (Fig. 1B, C). Même si SB2301 a montré une certaine cytotoxicité à des concentrations élevées (Fig. 1D), nous avons utilisé SB2301 à des concentrations où ce n'est pas un problème offrant une fenêtre d'opportunité pour les études biologiques ultérieures. Nous avons également observé un schéma similaire de réduction de la LD dans les cellules HepG2 du carcinome hépatocellulaire humain (Fig. 2A supplémentaire) et les cellules AML12 des hépatocytes de souris (Fig. 2B supplémentaire). Conformément à la réduction des LD cellulaires, la teneur en triglycérides cellulaires (TG) a été réduite de manière dose-dépendante (Fig. 1E). Sur la base de ces résultats, nous avons mené une étude plus approfondie pour déterminer le mécanisme par lequel SB2301 réduit les LD cellulaires.

A Structure chimique du SB2301 (4). B Images de fluorescence LD représentatives capturées lors du dépistage phénotypique. C La quantification du nombre de LD cellulaires dans les cellules HeLa après traitement avec diverses doses de SB2301 pendant 24 h. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (SD). D Courbes dose-réponse de la viabilité cellulaire lors du traitement au SB2301 pour les durées indiquées dans les cellules HeLa. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Résultats de la quantification E TG après un traitement au SB2301 pendant 24 h dans des cellules HepG2. Toutes les données sont représentées sous forme de diagrammes de points avec la moyenne ± SD, (n = 3). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. **P = 0,0068 par rapport au diméthylsulfoxyde (DMSO), ##P = 0,0029 par rapport au DMSO.

La DL cellulaire peut être réduite soit en empêchant leur formation (voie anabolique) soit en favorisant leur dégradation (voie catabolique). Nous n'avons observé aucun changement radical dans l'expression des gènes liés à la biosynthèse des lipides lors du traitement au SB2301 par analyse qPCR (Fig. 3A supplémentaire) et des protéines régulant la synthèse de TG / CE par analyse Western blot (Fig. 3B supplémentaire). De plus, la réduction de LD médiée par SB2301 n'a pas été inhibée par le co-traitement avec Orlistat, un inhibiteur de lipase courant (Fig. 3C supplémentaire). Au lieu de cela, nous avons confirmé que le traitement au SB2301 activait la dégradation de la LD via la lipophagie, un processus autophagique sélectif. Au cours de la progression de l'autophagie, la protéine 1 A/1B-chaîne légère 3 (LC3) I associée aux microtubules est lipidée pour devenir LC3 II à la surface du phagophore. Selon l'analyse Western blot, la conversion de LC3 I en II s'est produite lors du traitement au SB2301 de manière dépendante de la dose et du temps (Fig. 2A, B). Lorsque nous avons réduit le gène 5 lié à l'autophagie (ATG5), l'une des protéines clés de l'allongement du phagophore de l'autophagie, la conversion médiée par SB2301 de LC3 I en II a été complètement abolie (Fig. 2C). Nous avons ensuite examiné le flux autophagique médié par SB2301 lors d'un traitement avec la bafilomycine A1 (Baf), un modulateur connu de la H+-ATPase de type vacuolaire, inhibant la dégradation autolysosomale de la cargaison autophagique en empêchant son acidification, bloquant ainsi le flux autophagique à un stade avancé. Nous avons observé une augmentation de l'accumulation de LC3 II lors du co-traitement avec SB2301 et Baf de manière dose-dépendante (Fig. 2D). Nous avons également réalisé une imagerie de cellules vivantes avec la protéine mCherry-GFP-LC3 (Fig. 4 supplémentaire)30 ; En raison de la propriété d'extinction intrinsèque de la GFP dans des conditions acides, nous avons pu déterminer si les protéines LC3 fusionnées avec mCherry-GFP sont situées dans les autophagosomes (neutres) ou les autolysosomes (acides) en surveillant simplement les modifications du signal GFP tout en suivant la protéine LC3 avec un signal mCherry indépendant du pH. La rapamycine (Rap) active l'autophagie en inhibant la voie de signalisation de la cible mammifère de la rapamycine complexe 1 (mTORC1) et en induisant la formation de points lacrymaux rouges en raison de l'extinction du signal GFP dans les autolysosomes acides. En revanche, le traitement Baf arrête le flux autophagique de stade avancé en bloquant l'acidification lysosomale, ce qui a été confirmé par la formation de points lacrymaux jaunes via l'imagerie des cellules vivantes avec mCherry-GFP-LC3. Sur la base de nos expériences de contrôle avec l'inducteur d'autophagie (Rap) et l'inhibiteur (Baf), SB2301 a phénocopié l'inducteur d'autophagie, confirmant que SB2301 active l'autophagie.

Une analyse Western blot avec différentes doses de SB2301, de rapamycine (Rap, 2 μM) et de bafilomycine A1 (Baf, 20 nM) traitées dans des cellules HepG2 pendant 12 h. Analyse Western blot avec 10 μM de SB2301 pendant les temps indiqués (B), avec un traitement SB2301 sous la condition de knockdown du gène 5 (Atg5) lié à l'autophagie, suivi d'un traitement SB2301 pendant 9 h (C), et avec un traitement SB2301 en l'absence et présence de 5nM de Baf pendant 6h (D). E Images de fluorescence de cellules vivantes représentatives de LC3 (rouge, mCherry) et LD (vert, SF44) sur des cellules HeLa transfectées par mCherry-LC3 lors d'un traitement avec de la rapamycine (1 μM), de la chloroquine (10 μM) et du SB2301 (5 μM) pour 12h. F Images de fluorescence de cellules vivantes représentatives des lysosomes (rouge, lysotracker) et des LD (vert, SF44) lors du traitement avec la rapamycine (1 μM) et SB2301 (10 μM) sur des cellules HeLa pendant 12 h. G Images d'immunofluorescence représentatives de l'ubiquitine (rouge) et des LD (vert, BODIPY 493/503) sur des cellules HepG2 après traitement au SB2301 (10 μM) pendant 12 h. Une fois les cellules fixées, l'ubiquitine a été marquée avec un anticorps anti-ubiquitine et LD a été colorée avec BODIPY 495/503. H Quantification de l'intensité de fluorescence des images capturées en G. Les images ont été sélectionnées au hasard à partir de triplicats biologiques (n = 21 à partir de DMSO, n = 32 à partir de SB2301). Les signaux d'ubiquitine cytoplasmique ont été soustraits en arrière-plan et le rapport de signal fluorescent (ubiquitine/LD) sur chaque pixel a été calculé. Toutes les données sont représentées sous forme de dot plots avec la moyenne ± SD. Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. ***P = 0,0001.

Nous avons ensuite surveillé l'emplacement cellulaire de LD, LC3 (autophagosome) et des lysosomes lors du traitement au SB2301 pour déterminer si les LD étaient utilisés comme substrats d'autophagie. Comme le montrent la figure 2E et la figure supplémentaire 5A, Raf (un activateur de l'autophagie, pas un activateur de la lipophagie) n'a pas induit les LD à être entourés de LC3 en tant que sélection de substrat d'autophagosome médiée par LC3. Pendant ce temps, avec le traitement à la chloroquine (un inhibiteur de la dégradation lysosomale), les LD ont été piégés dans l'autophagosome. SB2301 a induit la formation d'autophagosomes via l'activation de l'autophagie, ce qui était cohérent avec le signal fluorescent amélioré de LC3. De plus, le traitement au SB2301 a augmenté la co-localisation de LD avec les protéines LC3 plus que le contrôle du diméthylsulfoxyde (DMSO) avec une réduction significative des signaux de fluorescence LD. Collectivement, nos résultats indiquent que SB2301 induit la séquestration de LD entiers ou partiels dans les autophagosomes, qui finissent par fusionner avec des lysosomes pour hydrolyser les LD (Fig. 2F et Fig. 5B supplémentaire). Pour déterminer si SB2301 induit l'autophagie dans des organites autres que les LD cellulaires, nous avons mesuré le contenu en ADN mitochondrial lors du traitement au SB2301 et confirmé que le contenu mitochondrial n'était pas affecté par ce traitement (Fig. 6 supplémentaire), indiquant que le SB2301 réduisait sélectivement les LD cellulaires en induisant la lipophagie.

L'ubiquitination est activement impliquée dans la reconnaissance des cargaisons sélectives d'autophagie31, telles que les mitochondries32,33, les agrégats de protéines34, les peroxysomes35 et les agents pathogènes36. Cependant, la lipophagie médiée par l'ubiquitine n'a pas encore été rapportée. Pour déterminer si la réduction de LD médiée par SB2301 via la lipophagie est régulée par un mécanisme médié par l'ubiquitine, nous avons effectué une imagerie par immunofluorescence contre l'ubiquitine dans les cellules HepG2. Comme le montre la Fig. 2G, les Fig. 7, 8, une ubiquitination substantielle s'est produite sur la surface LD lors du traitement au SB2301 par rapport à celle obtenue avec le traitement au DMSO. De plus, lorsque nous avons quantifié le rapport de l'ubiquitine au signal LD ​​après soustraction de fond avec des signaux d'ubiquitine cytoplasmique, le rapport était significativement plus élevé dans les conditions traitées avec SB2301 (Fig. 2H), confirmant que les protéines de surface LD étaient plus sélectivement ubiquitinées que les protéines cytoplasmiques. lors du traitement SB2301.

Pour étudier le mécanisme sous-jacent de SB2301 sur la lipophagie, nous avons mené une étude d'identification de cible en utilisant la différence de fluorescence basée sur le décalage de stabilité thermique dans l'électrophorèse sur gel bidimensionnelle (TS-FITGE). Cette technique est basée sur les changements caractéristiques de la stabilité des protéines induits par la dénaturation thermique lorsque la protéine interagit spécifiquement avec son ligand37. En bref, les cellules traitées au DMSO et au SB2301 ont été soumises à un choc thermique à des températures croissantes, et les lysats résultants ont été conjugués chimiquement avec des esters Cy3 et Cy5-N-hydroxysuccinimide, respectivement. Par la suite, deux protéomes (marqués par fluorescence avec Cy3 et Cy5) de chaque condition de température ont été combinés et analysés par électrophorèse sur gel 2D. Enfin, l'analyse basée sur l'image de fluorescence du gel 2D a révélé des changements de couleur des taches de protéines individuelles, qui ont été causés par des changements dans la stabilité thermique d'une protéine lors de l'engagement avec SB2301.

Comme le montrent la figure 3A et la figure supplémentaire 9, environ neuf points rouges ou verts sont apparus à plusieurs reprises dans les images de gel 2D d'échantillons traités à des températures plus élevées, indiquant une stabilité thermique des protéines améliorée (rouge) ou réduite (vert) lors de l'engagement de SB2301. Quatorze protéines candidates ont été identifiées par spectrométrie de masse (tableau supplémentaire 2). Un essai de décalage thermique cellulaire (CETSA) a été effectué sur plusieurs protéines candidates pour valider les expériences d'identification de cible (Fig. 3B et Fig. 10 supplémentaire). Pour hiérarchiser les protéines candidates cibles, nous avons mené une étude bibliographique sur leurs fonctions et sélectionné trois protéines, PCYT2 (éthanolamine-phosphate cytidylyltransférase 2), ACSL4 (long-chain-fatty-acid-CoA ligase 4) et IDH1 (isocitrate déshydrogénase [ NADP] cytoplasmique), qui sont étroitement liés au métabolisme des lipides cellulaires. Nous avons ensuite vérifié si chaque protéine cible pouvait influencer la quantité ou la taille des LD cellulaires avec une étude de perte de fonction. Comme le montrent la Fig. 3C et la Fig. 11 supplémentaire, nous avons observé que le niveau cellulaire de PCYT2 était inversement corrélé au nombre de LD cellulaires, ce qui suggère que PCYT2 pourrait influencer le mécanisme d'activation de la lipophagie de SB2301.

A Images superposées du canal Cy3 (vert, protéome traité au DMSO) et du canal Cy5 (rouge, protéome traité au SB2301). Les points indiqués (flèche blanche) virent au rouge à 59,1 °C puis disparaissent à 63,1 °C. B Immunoblot de CETSA représentant la liaison spécifique de SB2301 avec PCYT2. 20 μM de SB2301 et le composé négatif (10) ont été traités sur des cellules HepG2 pendant 1 h. Le nombre de C LD change lors de l'épuisement de Pcyt2, Acsl4 et Idh1 en utilisant les siARN respectifs. Les cellules HepG2 ont été transfectées avec des siARN pendant 48 h, puis les images LD fluorescentes ont été obtenues. Toutes les données sont représentées sous forme de diagrammes de points avec la moyenne ± SD, (n = 3). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. *P = 0,0123 vs si-scr. D Sensorgrammes représentatifs de l'analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) de la liaison du SB2301 au PCYT2 humain. La constante de dissociation à l'équilibre (KD) a été calculée après ajustement 1:1 avec mode cinétique (supérieur) ou affinité (inférieur).

Nous avons ensuite mené une expérience biophysique pour examiner la liaison spécifique de SB2301 à PCYT2 à l'aide d'une analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) et avons confirmé l'engagement direct de SB2301 avec PCYT2 dans un mode de liaison 1: 1 (Fig. 3D). Étant donné que la valeur estimée de la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) de SB2301 pour PCYT2 était d'environ 26 μM, PCYT2 peut ne pas être la seule protéine cible de SB2301. Cependant, ses analogues synthétiques (3 et 10), dépourvus d'activité de réduction de LD, n'ont montré aucun changement de stabilité thermique avec PCYT2 dans CETSA (Fig. 12 supplémentaire) et aucun événement de liaison dans l'analyse SPR (Fig. 13A, B supplémentaires). En revanche, dans le cas de l'analogue synthétique 14 (activité modérée de réduction de la LD avec cytotoxicité) ou 13 (activité minimale de réduction de la LD), nous avons observé une liaison directe avec PCYT2 avec une tendance similaire à leur activité de réduction de la LD (Fig. 13C supplémentaire , D). Par conséquent, nous avons conclu que PCYT2 pourrait être une protéine cible potentielle corrélée à la réduction des LD cellulaires médiée par SB2301.

PCTY2 est connu pour catalyser la synthèse de CDP-éthanolamine, un précurseur de la synthèse de PE dans le cytosol38. La choline/éthanol-amine phosphotransférase (CEPT) synthétise la PE en utilisant la CDP-éthanolamine sur la membrane du RE, et l'étape médiée par PCYT2 est l'étape déterminante de la vitesse de synthèse cellulaire de la PE (schéma supplémentaire 2)39. Sur la base de ces informations, nous avons étudié les changements qui pourraient survenir lorsque SB2301 se lie à PCYT2. Bien que la fonction enzymatique de PCYT2 n'ait pas été affectée par le traitement au SB2301 (Fig. 14 supplémentaire), nous avons observé la translocation de PCYT2 à la surface LD même après une courte durée de traitement (en 1 h) (Fig. 4A, B pour SB2301, Fig. supplémentaire .15 pour le DMSO). De plus, SB2301 a induit la translocation de PCYT2 vers la surface LD de manière dépendante du temps et de la dose (Fig. 16 supplémentaire et vidéo supplémentaire 1–4). Notamment, des LD de grande taille ont commencé à se former dans un délai similaire de translocation de PCYT2 à la surface de LD (Fig. 4A, C, Fig. 7A, 17 supplémentaires pour SB2301 et Fig. 18 supplémentaire pour DMSO). Ainsi, nous avons déduit que l'élargissement de LD pourrait survenir avec la translocation PCYT2 induite par SB2301, ce qui permet l'apport direct et rapide de CDP-éthanolamine à la surface LD et l'augmentation ultérieure de PE sur la surface LD. Les principaux composants phospholipidiques de la membrane LD sont PE et PC3. Le PC adopte une forme cylindrique, tandis que le PE adopte une forme conique en raison de sa tête polaire plus petite40. En raison des propriétés biophysiques et des formes globales différentes des deux phospholipides, le rapport PE/PC dans la membrane LD influence la courbure et la taille de LD pour rester dans un état d'entropie minimale40. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que SB2301 induit la translocation de PCYT2 à la surface LD, et cette relocalisation spatio-temporelle de PCYT2 augmente préférentiellement les niveaux de PE à la surface LD, ce qui conduit par conséquent à la coalescence de petits LD instables en grands LD pour minimiser la surface. tension en réduisant leur courbure (Fig. 4D). Nous avons mesuré le rapport PE/PC dans les LD cellulaires pour tester cette hypothèse. Bien que nous n'ayons observé aucun changement dans la quantité de PE ou de PC dans les cellules entières traitées au SB2301 (Fig. 19 supplémentaire), des augmentations substantielles du rapport PE / PC des LD isolées ont été observées (Fig. 4E). Ainsi, la quantité de PE sur la surface LD a été augmentée par la translocation PCYT2 induite par SB2301, et le rapport PE/PC résultant à la surface LD a perturbé sa stabilité biophysique, entraînant par la suite une coalescence LD.

A Images d'immunofluorescence représentatives de PCYT2 (vert) et LD (bleu, BODIPY 493/503). Les cellules HepG2 ont été traitées avec 10 μM de SB2301 aux temps indiqués. Les cellules ont été fixées et immunocolorées pour la détection de PCYT2. B Quantification de PCYT2 sur le LD. La zone superposée entre LD et PCYT2 dans chaque condition expérimentale a été analysée à l'aide du logiciel ImageJ. Les images ont été sélectionnées au hasard à partir de triplicats biologiques. Toutes les données sont représentées sous forme de dot plots avec la moyenne ± SD. Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. *P = 0,0423, **P = 0,0038, ***P = 0,0002. C La distribution de taille des LD purifiés a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière. Les cellules HepG2 ont été traitées avec 10 μM de SB2301 pendant 9 h avant la purification des LD cellulaires. D Illustration schématique de la coalescence des LD via la modulation de leur rapport PE/PC. E La mesure du rapport PE/PC dans les LD purifiées montre que le traitement au SB2301 augmente spatialement le rapport PE/PC. Toutes les données sont représentées sous forme de diagrammes de points avec la moyenne ± SD, (n = 3). Les données ont été analysées à l'aide du test t apparié. **P = 0,0077. F Le degré de contribution et les LD restantes ont été analysés à partir des images de fluorescence LD à chaque instant. Le degré de contribution a été calculé selon la définition. Le nombre de LD restants a été obtenu en divisant la surface totale de LD par le nombre de cellules. Lors du traitement au SB2301, le mode du graphique bleu (la condition traitée au SB2301) s'est déplacé vers le plus grand diamètre LD, puis est revenu à sa valeur d'origine. Les images de fluorescence LD ont été capturées à partir de cellules HepG2 traitées avec 20 μM de SB2301 pendant les durées indiquées. Toutes les données sont représentées par la moyenne ± SD. G, H Images de fluorescence LD représentatives et résultats de quantification sur les cellules HepG2 Atg5-knockdown. Les cellules appauvries en ATG5 ont été traitées avec 20 μM de SB2301 pendant 48 h. Le degré de contribution des LD a été analysé comme décrit dans E. Toutes les données sont représentées par la moyenne ± SD. I, J Images de fluorescence LD représentatives et résultats de quantification des cellules HepG2 Ubb-knockdown. Les cellules appauvries en UBB ont été traitées avec 20 μM de SB2301 pendant 48 h. Le degré de contribution des LD a ensuite été analysé comme décrit dans E. Toutes les données sont représentées par la moyenne ± SD.

Pour élucider la corrélation entre la lipophagie et l'augmentation du rapport PE/PC au niveau de la membrane LD, nous avons systématiquement analysé les changements dynamiques de la taille LD. La coalescence des petits LD au cours de la période antérieure de traitement au SB2301 expliquait la diminution du nombre de LD cellulaires sans activer complètement le processus d'autophagie (Fig. 2A supplémentaire). La proportion de grands LD a progressivement augmenté vers 6 h (Fig. 4A et Fig. 16 supplémentaire). Au cours de la même période, la voie de l'autophagie a également été activée (Fig. 2B). En analysant le degré de contribution des LD cellulaires au fil du temps, nous avons observé un changement dynamique des volumes de LD cellulaires (Fig. 4F). Lors du traitement SB2301, la coalescence LD s'est produite jusqu'à 18 h; par la suite, la proportion de grands LD n'a plus augmenté et a commencé à diminuer en raison de la dégradation continue des LD. Finalement, la distribution de taille LD est revenue à sa valeur d'origine, mais le volume total de LD cellulaire a été réduit à 64, 2% à 24 h (Fig. 4F). Cependant, la distribution du volume LD n'est pas revenue à son schéma d'origine même après le traitement au SB2301 sous Atg5- (Fig. 4G, H et Fig. 21 supplémentaires pour SB2301; Figs. 4J, I et Fig. 21 supplémentaire pour SB2301 ; Fig. 20, 21 supplémentaires pour DMSO). De ces observations, nous avons déduit que le traitement au SB2301 induisait la translocation de PCYT2 à la surface du LD et que le rapport PE/PC augmentait au niveau de la membrane du LD, conduisant à la coalescence du LD. La fusion LD via une augmentation du rapport PE / PC s'est produite en premier indépendamment de l'autophagie. Les grandes DL défavorables qui en résultent peuvent déclencher une lipophagie médiée par l'ubiquitine.

Nous avons effectué une expérience de chasse aux impulsions d'acides gras sans fluorescence41 pour déterminer le sort des AGL produits par la lipophagie. Le FFA marqué BODIPY (BODIPY-C12) est l'un des meilleurs réactifs pour suivre le mouvement intracellulaire des FFA à partir de LD simplement en surveillant le signal de fluorescence de BODIPY-C12. Par exemple, les cellules à forte demande énergétique peuvent activer la lipophagie et prolonger la β-oxydation mitochondriale des AGL pour produire plus d'ATP pour leur survie42. Lorsque les cellules ont été incubées avec BODIPY-C12, puis ont été appauvries en sérum, plus de FFA ont été trouvés dans les mitochondries que dans les LD (Fig. 5A, B). De même, nous avons observé que le traitement au SB2301 induisait la dégradation des LD cellulaires via la lipophagie et produisait des FFA qui s'accumulaient dans les mitochondries pour la β-oxydation (Fig. 5A, B). Nous avons mesuré le taux de consommation d'oxygène (OCR) des cellules en l'absence et en présence de SB2301 et avons confirmé que les cellules augmentaient leur capacité respiratoire de réserve (SRC) en réponse au traitement par SB2301 (Fig. 5C, D et Supplémentaire Fig. 22). Les cellules ajustent leurs états métaboliques avec une SRC mitochondriale améliorée dans des conditions de forte demande énergétique ou de stress élevé pour se protéger des stimuli environnementaux43,44,45. Semblable à l'augmentation du SRC, les cellules répondent aux stimuli environnementaux via la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), un capteur d'énergie représentatif, et activent sa signalisation en aval pour réguler la β-oxydation46 ; L'activation de l'AMPK permet la phosphorylation et l'inactivation de l'acétyl-CoA carboxylase (ACC), un puissant inhibiteur de l'oxydation mitochondriale des acides gras, entraînant une augmentation de l'oxydation des acides gras47,48. Par analyse Western blot, nous avons confirmé que l'AMPK et l'ACC étaient phosphorylés par SB2301 (Fig. 23 supplémentaire). L'augmentation de la phosphorylation de l'ACC médiée par SRC et AMPK lors du traitement par SB2301 a indiqué que les cellules activaient le système tampon pour consommer ou éliminer les FFA produits par la lipophagie médiée par SB2301, réduisant ainsi le stress cellulaire tel que la lipotoxicité.

A Images représentatives de fluorescence de cellules vivantes du test de chasse par impulsion FFA avec FFA marqué au BODIPY. 2 μM de BODIPY-C12 ont été traités sur des cellules HeLa pendant 21 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec 5 μM de SB2301 ou incubées dans un milieu sans sérum pendant 24 h supplémentaires. Les mitochondries ont été colorées avec Mitotracker et LD a été colorée avec SF44. Les images ont été fusionnées en désignant le rouge pour les mitochondries, le bleu pour BODIPY-C12 et le vert pour LD. Le coefficient de corrélation B Pearson a été calculé pour démontrer la colocalisation des signaux BODIPY-C12 et Mitotracker. Les images ont été sélectionnées au hasard à partir de triplicats biologiques. Toutes les données sont représentées sous forme de dot plots avec la moyenne ± SD. Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. **P = 0,0052 contre DMSO, ##P = 0,0070 contre DMSO. C Mesure du taux de consommation d'oxygène. Les cellules AML12 ont été traitées avec 20 μM de SB2301 pendant 24 h. Toutes les données sont représentées par la moyenne ± SD. Pourriture + Fourmi ; roténone + antimycine A. D Capacité respiratoire inutilisée calculée (capacité respiratoire maximale - respiration basale) à partir de C. Toutes les données sont représentées sous forme de diagrammes de points avec la moyenne ± SD, (n = 4). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. ***P = 0,0004.

La dégradation de la LD peut être un phénotype unique et bénéfique pour la découverte de médicaments, car une accumulation excessive de LD est fortement corrélée aux principales causes de diverses maladies métaboliques18. De plus, la quantité de FFA régule les maladies du foie gras non alcooliques49. Dans ce contexte, le mécanisme de la lipophagie activée par le SB2301 pourrait constituer une stratégie thérapeutique potentielle, car le SB2301 réduit efficacement la LD et consomme des AGL. Pour explorer ce nouveau mécanisme d'activation de la lipophagie en tant que stratégie thérapeutique, nous avons appliqué SB2301 à des modèles de maladies in vitro, en particulier la stéatose hépatique. Pour développer un modèle de stéatose in vitro, nous avons utilisé deux systèmes modèles en traitant les cellules HepG2 avec de l'acide oléique (OA) 50 et du tamoxifène (TM) 51 pour imiter un système alimentaire simple riche en graisses et un système de stéatohépatite sévère, respectivement. Dans les deux modèles de stéatose hépatique, le SB2301 a réduit le nombre et la surface de la LD cellulaire de manière dose-dépendante (Fig. 6). Ces découvertes confirment que le mécanisme de réduction de la LD induit par la lipophagie récemment étudié pourrait être utilisé comme stratégie thérapeutique pour les maladies métaboliques, y compris la stéatose hépatique non alcoolique et la stéatohépatite non alcoolique.

A Images LD de fluorescence de cellules vivantes représentatives de SB2301 dans des modèles de stéatose hépatique traités par OA et TM. B Résultats de la quantification du nombre de LD cellulaires et de la zone de A. Toutes les données sont représentées sous forme de diagrammes de points avec la moyenne ± SD, (n = 3). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié. ****P < 0,0001, ***P = 0,001, $$$P = 0,0002 par rapport au DMSO, ###P = 0,0004, **P = 0,0093 par rapport au DMSO.

La LD cellulaire régule l'homéostasie énergétique et le métabolisme des lipides en modifiant sa quantité et sa taille en réponse aux changements environnementaux, tels que les états pathologiques et les conditions énergétiques52. La recherche LD a suscité un intérêt considérable dans le milieu universitaire et l'industrie en raison de sa pertinence dans les conditions physiopathologiques. Cependant, seules quelques études ont exploré les mécanismes de régulation des LD cellulaires, notamment par autophagie sélective, à savoir la lipophagie. Ici, nous avons découvert une petite molécule bioactive, SB2301, qui réduit les LD cellulaires sans cytotoxicité sévère via une approche basée sur le phénotype. Nous avons ensuite démontré que SB2301 réduisait les LD cellulaires en activant l'autophagie sélective en surveillant la séquestration des LD dans les autophagosomes et les autolysosomes, entraînant une dégradation lysosomale. Fait intéressant, le traitement au SB2301 a favorisé l'ubiquitination sur la surface du LD, permettant la reconnaissance spécifique du substrat pour l'autophagie sélective31,32,35, bien que les LD ubiquitinées et leur association avec la lipophagie n'aient pas encore été rapportées. Par conséquent, nous avons découvert un nouveau mécanisme moléculaire de la lipophagie médiée par l'ubiquitine intracellulaire. Plusieurs questions restent sans réponse, notamment l'identité des protéines ubiquitinées à la surface du LD et le mécanisme par lequel le phagophore reconnaît et séquestre les LD ubiquitinées53. Néanmoins, SB2301 combiné à la protéomique quantitative peut servir d'outil de recherche unique pour étudier les nouveaux mécanismes de lipophagie médiés par l'ubiquitine.

PCYT2 a été identifié comme une protéine cible de SB2301 à l'aide de TS-FITGE. Le traitement au SB2301 a induit la translocation de PCYT2 vers les LD cellulaires sans affecter son activité enzymatique. Nous pensons que la translocation médiée par SB2301 de PCYT2 à la surface du LD pourrait activer une augmentation du rapport PE/PC spécifiquement au niveau des LD, influençant ainsi leur stabilité biophysique. En conséquence, le LD déstabilisé a fusionné pour minimiser sa courbure, et les cellules activent la lipophagie pour maintenir l'homéostasie en éliminant les grands LD défavorables. Actuellement, on ne sait pas comment SB2301 induit la translocation de PCYT2 vers la surface LD et doit mener l'étude d'inactivation de PCYT2 pour démontrer l'exigence de PCYT2 pour l'activité de SB2301. Cependant, les résultats obtenus dans cette étude servent d'étude pilote pour élucider le mécanisme moléculaire détaillé de la translocation de PCYT2 et des processus de lipophagie médiée par l'ubiquitine.

Ici, nous avons montré que SB2301 modifie la composition membranaire des LD cellulaires par la régulation spatiale de PCYT2, qui fournit directement du CDP-éthanolamine à la membrane LD. La CEPT assure la médiation de la liaison de la CDP-éthanolamine avec le diacylglycérol, l'étape finale de la synthèse de la PE, et la CEPT n'existe qu'à la surface du RE54. Cependant, on sait que la CDP-choline ne nécessite pas nécessairement la CEPT pour synthétiser PC sur LD. De plus, la translocation de la choline-phosphate cytidylyltransférase (PCYT1A) vers LD elle-même peut augmenter la quantité de PC et empêcher la fusion de LD55. La similitude entre PE et PC dans leur mécanisme de biosynthèse et leur synthèse spatiale56 pourrait soutenir le mécanisme proposé dans cette étude. Collectivement, SB2301 a induit la translocation de PCYT2, entraînant une augmentation spatiale du rapport PE/PC dans la membrane LD. L'instabilité biophysique résultante de la membrane LD provoque la coalescence LD et active la lipophagie médiée par l'ubiquitine pour maintenir l'homéostasie cellulaire. D'autres études protéomiques pour l'interactome de la protéine cible PCTY2 et l'identification des protéines de surface LD ubiquitinées seraient essentielles pour démontrer comment la surface LD coalescente induit l'ubiquitination des protéines, active la lipophagie et identifie les acteurs clés de ce mécanisme d'activation de la lipophagie. Néanmoins, cette lipophagie médiée par l'ubiquitine pourrait fournir une nouvelle stratégie pour réduire la teneur en lipides intracellulaires sans induire de lipotoxicité, car les AGL produits à partir de LD dégradées peuvent être consommés dans les mitochondries, comme le montre cette étude basée sur le phénotype. De plus, la réduction de la DL cellulaire dans des modèles de stéatose hépatique in vitro a été démontrée comme une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques causées par l'accumulation de graisse, y compris la stéatohépatite non alcoolique.

Anti-LC3B (ab51520), anti-PCYT2 (ab126142), anti-IDH1 (ab81653), anti-ubiquitine (ab7780), anti-ATG5 (ab108327), anticorps secondaires anti-IgG de lapin conjugués au TRITC (ab6718) et anti- -DGAT1 (ab178711) ont été achetés chez Abcam. L'anticorps anti-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (CST 2118), l'IgG anti-souris marqué au HRP (CST 7076) et les anticorps secondaires anti-IgG de lapin marqués au HRP (CST 7074) ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology. Les anti-ACSL4 (sc-271800) et anti-WDR1 (sc-393159) ont été achetés auprès de SantaCruz. L'anti-SOAT1 (Novus Biologicals, NB400-141) a été acheté chez Novus Biologicals. L'anti-SOAT2 (Cayman, 100027) a été acheté chez Cayman. L'anti-DGAT2 (Thermo, PA5-21722) a été acheté chez Thermo Scientific.

Le plasmide mCherry-GFP-LC3 (vecteur pBabe) a été fourni par le Dr Heesun Cheong, Division de biologie chimique, Institut de recherche, Centre national du cancer, Corée. Le plasmide mCherry-LC3 a été acheté chez Addgene (40827).

Le système d'imagerie DeltaVision Elite de GE Healthcare a été utilisé pour l'expérience d'imagerie haute résolution. Les lentilles d'objectif ont été équipées d'un microscope inversé Olympus IX-71. Une caméra sCMOS et un module d'éclairage par fluorescence InSightSSI ont été équipés du système. Pour l'imagerie des cellules vivantes, une chambre de support de CO2 avec un réchauffeur d'air objectif a été installée avec le système. Les images ont été analysées avec le programme SoftWorks pris en charge par GE Healthcare.

Les cellules HepG2 ont été cultivées dans du milieu d'aigle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % (v/v) de solution antibiotique-antimycotique (AA). Des cellules cancéreuses cervicales humaines HeLa ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 avec 10 % (v/v) de FBS et une solution à 1 % d'AA. Les cellules AML12 ont été cultivées dans du DMEM/F12 (1:1) (Gibco, 11330-032), 1 × supplément d'insuline-transferrine-sélénium-G (Gibco, 41400-045), dexaméthasone (40 ng/ml finaux), 10 % (v/v) FBS et 1 % (v/v) de solution AA. Les cellules ont été maintenues dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm dans un incubateur à 37 ° C, dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.

Les cellules vivantes ont été traitées avec du SF44 (10 μM) et du Hoechst 33342 (2 μg/ml). La condition sans sérum (en tant que témoin positif) a été remplacée par un milieu complet avant le traitement avec SF44 et Hoechst. Après 30 minutes d'incubation, une imagerie de fluorescence automatique a été réalisée avec InCell Analyzer 2000 [GE Healthcare] ou DeltaVision Elite [GE Healthcare] sans lavage. À l'aide d'InCell Analyzer 2000, des images de quatre points sélectionnés au hasard par puits individuels dans une plaque à 96 puits ont été automatiquement capturées. Les images ont été prises en mode autofocus avec un grossissement de 20×. L'imagerie de fluorescence a été réalisée en utilisant les paramètres de filtre suivants : excitation_émission, 430/24 nm_605/64 nm pour LD ; 350/50 nm_455/50 nm pour le noyau dans InCell Analyzer 2000 ou 438/24 nm_559/38 nm pour LD ; 380/18 nm_435/48 nm pour le noyau dans DeltaVision Elite. Selon le protocole du fabricant, les données ont été analysées avec le programme InCell Developer. L'intensité de fluorescence de LD a été interprétée comme un organite cellulaire à l'aide d'un module de granularité, et la zone des cellules individuelles a été reconnue par la coloration des noyaux à l'aide de la segmentation du collier.

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque transparente à 96 puits suivie d'un traitement composé pendant les durées indiquées. Le test de viabilité cellulaire a été effectué avec le test WST en suivant le protocole du fabricant.

Les cellules HepG2 ont été ensemencées sur une plaque à 12 puits suivies d'un traitement composé pendant le temps indiqué. La quantité de triglycérides a été mesurée par un kit de dosage des triglycérides (Abcam, ab65336), suivant le protocole du fabricant.

Les cellules HepG2 ont été traitées avec SB2301 pendant les durées indiquées. L'ADN génomique a été extrait des cellules HepG2 avec le kit d'extraction d'ADN DNeasy (Qiagen, 69581) selon les instructions du fabricant. 20 ng d'ADN génomique ont été soumis à une PCR quantitative (qPCR). Le mélange maître KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR (KK4605) et les amorces sens/sens (200 nM) contre l'ADN mitochondrial humain ou le GAPDH humain ont été mélangés dans un volume final de 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La PCR a été réalisée avec StepOnePlus (Applied Biosystems) et le cycle PCR a été utilisé ; dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 3 s et extension à 60 °C pendant 25 s. Les données ont été analysées par la méthode CT comparative et les niveaux d'ADN mitochondrial ont été normalisés aux niveaux de GAPDH.

L'ARNm total a été isolé à partir de cellules HepG2 traitées avec SB2301 à l'aide du mini kit RNeasy Plus (Qiagen 74134). La réaction de transcription inverse (RT) a été réalisée avec AccuPower Cycle Script RT PreMix (Bioneer, K-2044) avec 1 μg d'ARNm total dans un volume final de 20 μl avec de l'eau sans nucléase dans les conditions suivantes : 12 cycles avec annelage d'amorce à 30 °C pendant 1 min et synthèse d'ADN à 50 °C pendant 4 min. 1 μl de produit RT a été soumis à une PCR quantitative (qPCR). Le mélange maître KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR (KK4605) et les amorces sens/sens (200 nM) contre chaque gène ont été mélangés dans un volume final de 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La PCR a été réalisée avec StepOnePlus (Applied Biosystems) et le cycle PCR a été utilisé ; dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 3 s et extension à 60 ° C pendant 30 s. Les données ont été analysées par la méthode CT comparative, et chaque niveau d'expression a été normalisé aux niveaux de GAPDH.

Les cellules ont été lysées avec un tampon de test de radio-immunoprécipitation (RIPA) (Tris 50 mM, pH 7, 8, NaCl 150 mM, désoxycholate à 0, 5%, IGEPAL CA-630 à 1%) et un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche). Les lysats ont été obtenus après centrifugation à 15 000 rpm pendant 20 min, en transférant le surnageant. La concentration en protéines a été quantifiée avec le kit de dosage des protéines BCA. Les procédures globales d'échantillonnage des protéines ont été effectuées à 4 ° C. Les échantillons de protéines préparés ont été analysés avec SDS-PAGE suivi d'une procédure de Western blot. Les protéines ont été transférées dans la membrane PVDF, et celle-ci a été bloquée avec 2% de BSA dans du TBST pendant 1 h à température ambiante (rt). Les anticorps primaires ont été traités pendant une nuit à 4 °C [Anti-LC3B ; 1:2000, anti-ATG5 ; 1:1000, anti-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH); 1:2000, anti-DGAT1 ; 1:1000, anti-DGAT2 ; 1:1000, anti-SOAT1 ; 1:500, anti-SOAT2 ; 1:500] suivi d'un lavage avec du TBST. Les IgG anti-lapin marqués au HRP ou les anticorps secondaires IgG anti-souris marqués au HRP (1: 5000) ont été traités à température ambiante pendant 1 h. Après lavage au TBST, la membrane a été développée par Amersham ECL prime solution. Le signal chimioluminescent a été mesuré par le système d'imagerie ChemiDocMP.

Les cellules HeLa ont été ensemencées sur Lab-Tek II Chambered Coverglass w/Cover #1.5 Borosilicate Sterile/8 Well (Nunc 155409), 24 h avant la transfection. Le plasmide mCherry-GFP-LC3 ou le plasmide mCherry-hLC3 a été transfecté dans des cellules HeLa à l'aide du réactif Lipofectamine 2000. La transfection a été effectuée selon le protocole du fabricant.

Des images de fluorescence de cellules HeLa transfectées avec mCherry-GFP-LC3 ont été obtenues à l'échelle 60 ×, en utilisant des ensembles de filtres mCherry/mCherry, GFP/GFP (excitation/émission). mCherry (excitation : 575/25 nm, émission : 625/45 nm) ; et GFP (excitation : 475/28 nm, émission : 525/48 nm). Les images ont été analysées avec le logiciel de déconvolution SoftWorks.

Les cellules HeLa transfectées par mCherry-hLC3 ont été traitées avec du SF44 (10 μM) pendant 30 minutes avant l'imagerie. Les images de fluorescence ont été obtenues à un grossissement de 100 × à l'aide de jeux de filtres mCherry/mCherry (excitation_emission, 575/25 nm_625/45 nm) et CFP/YFP (excitation_emission, 438/24 nm_559/38 nm). Les images ont été analysées à l'aide du logiciel de déconvolution SoftWorks.

Avant l'imagerie par fluorescence, les lysosomes ont été colorés avec Lysotracker DeepRed (50 nM, Thermo Scientific, L7528) pendant 1,5 h. Les LD ont été colorées avec du SF44 (10 μM) et les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342 (2 μg/ml) pendant 30 min. Les images ont été obtenues à un grossissement de 100× en utilisant Cy5/Cy5, (excitation_emission, 632/22 nm_676/34 nm), FITC/TRITC (excitation_emission, 475/28 nm_594/45 nm) et DAPI/DAPI (excitation_emission, 380/ 18 nm_435/48 nm). Les images ont été analysées à l'aide du logiciel de déconvolution SoftWorks.

Les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide et fixées avec du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS. Les cellules ont été incubées dans du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 15 min à ta pour la perméabilisation. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS glacé, suivi d'une incubation avec 2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Les cellules fixées sur des plats ont été exposées à la solution d'anticorps primaire diluée (ubiquitine ; 1 : 300, PCYT2 ; 1 : 200 ) dans du PBS avec 1 % de BSA et 3 μM de BODIPY 493/503 (Thermo, D3922) à 4 °C pendant la nuit. L'anticorps primaire a été décanté et lavé trois fois avec du PBS. Par la suite, une solution diluée d'anticorps IgG-TRITC anti-lapin (1:200) avec 3 μM BODIPY 493/503 et Hoechst 33342 (2 μg/ml) a été appliquée aux échantillons et incubée à température ambiante pendant 1 h. Après trois lavages avec du PBS, les images de fluorescence ont été capturées à l'aide de la microscopie à fluorescence DeltaVision Elite (100×) en utilisant TRITC/TRITC, (excitation_emission, 542/27 nm_594/45 nm), FITC/FITC (excitation_emission, 475/28 nm_525/48 nm ), et DAPI/DAPI (excitation_émission, 380/18 nm_435/48 nm). Les images ont été analysées à l'aide du logiciel de déconvolution SoftWorks.

Des cellules HepG2 de carcinome hépatocellulaire humain ont été incubées dans du DMEM sans sérum avec 20 μM de SB2301 (0, 2% (v / v) de DMSO en concentration finale) pendant 1 h à 37 ° C. Un choc thermique a été appliqué aux cellules pendant 3 min. Les cellules résultantes ont été stabilisées à 25 ° C pendant 3 min, lavées une fois avec du PBS et remises en suspension dans du PBS contenant 0, 4% de NP-40 et un inhibiteur de protéase. Les cellules ont été soumises à trois cycles de congélation (azote liquide)/décongélation pour la lyse cellulaire. Le lysat cellulaire a été clarifié par centrifugation à 20 000 g pendant 20 min à 4 °C. 50 mg de protéine ont été précipités et le culot résiduel a été remis en suspension dans 10 μl de tampon de marquage (Tris-HCl 30 mM à pH 8, 6, thiourée 2 M, urée 7 M et CHAPS 4% (p / v)) avec sonication. Les protéomes solubles ont été mélangés avec du Cy3-NHS 0, 4 mM (pour le groupe traité au DMSO) ou du Cy5-NHS (pour le groupe traité au SB2301) et incubés à 4 ° C pendant 45 min. Les protéomes conjugués au colorant ont été précipités avec de l'acétone froide et remis en suspension dans 75 µl de tampon de réhydratation (urée 7 M, thiourée 2 M, CHAPS 2 % (p/v), DTT 40 mM et tampon IPG 1 %). Des échantillons traités au SB2301 traités au DMSO ont été mélangés et 150 μl (75 μl pour Cy3 et Cy5 marqués chacun) de protéomes ont été chargés sur un gel Immobiline Drystrip de 24 cm [GE Healthcare]. La focalisation isoélectrique a été réalisée à l'aide d'Ettan IPGphor 3 [GE Healthcare] suivie d'une SDS-PAGE bidimensionnelle avec un système Ettan DALTsix [GE Healthcare]. Le gel a été scanné à l'aide d'un Typhoon Trio [GE Healthcare]. Pour LCMS/MS, le gel a été excisé après coloration à l'argent.

Les taches de protéines du gel coloré à l'argent ont été excisées, décolorées et digérées avec de la trypsine. Le mélange a été évaporé dans du SpeedVac puis dissous dans de l'acétonitrile à 10 % avec de l'acide formique à 0,1 %. Les peptides résultants ont été dessalés dans une colonne piège (180 μm × 20 mm, Symmetry C18) et séparés sur une colonne analytique en phase inverse C18 (75 μm × 200 mm, 1,7 μm, BEH130 C18) [Waters] avec un électrospray ionisation Pico Pointe (±10 μm id) [Nouvel objectif]. Les données ont été converties en fichiers.pkl par Protein Lynx Global Server et recherchées par le moteur MASCOT avec la base de données SwissProt.

Des cellules HepG2 trypsinisées ont été incubées dans un milieu DMEM sans sérum avec le composé 20 μM (concentration finale de 0, 2% (v / v) de DMSO) pendant 1 h à 37 ° C. Choc thermique appliqué à la cellule pendant 3 min et les cellules ont été stabilisées à 25 ° C pendant 3 min. Laver la cellule avec du PBS une fois et remettre en suspension les cellules avec du PBS contenant 0,4 % de NP-40 et un inhibiteur de protéase. Cellules de lyse avec cycle de congélation (azote liquide)/décongélation, trois fois. Préparer les protéines solubles et détecter la quantité de protéines avec Western Blot. (Dilution d'anticorps primaire/anti-ACSL4 ; 1:1000, anti-PCYT2 ; 1:1000, anti-IDH1 ; 1:1000, anti-WDR1 ; 1:200, anti-GAPDH ; 1:2000).

20 μM d'ARNsi ont été appliqués sur des cellules HepG2 pendant 48 h avec Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13778-100) selon les protocoles du fabricant.

La constante de dissociation à l'équilibre (Kd) vers PCYT2 a été déterminée par SPR à l'aide d'un instrument Biacore T100 [GE Healthcare]. Le groupe carboxyle à la surface de la puce du capteur CM5 a été remplacé par un ester de succinimide réactif à l'aide d'une combinaison de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) et de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans les cellules d'écoulement 1 et 2 Le PCYT2 humain (Prospec, enz-221) a été immobilisé sur la Flow Cell 2 (10 000 RU) par la formation de liaisons amide avec l'ester NHS résultant. L'ester NHS restant sur les cellules d'écoulement 1 et 2 a été trempé par injection avec une solution 1 M d'éthanolamine-HCl (pH 8,0). Pendant le processus d'immobilisation, du PBS a été utilisé comme tampon courant. Après immobilisation, différentes concentrations des composés ont été injectées pendant 60 s à un débit de 10 μL.min-1. Au même débit, la dissociation de la surface du capteur a été surveillée pendant 300 s. Pour le tampon courant, nous avons utilisé 1 × PBS (pH 7,3) contenant 3 % de DMSO et 0,05 % de P20. Les événements de liaison ont été mesurés à 25 °C. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore T100 [GE Healthcare]. Les sensorgrammes finaux ont été obtenus après l'élimination des réponses de la Flow Cell 1 et du contrôle tampon uniquement. Le Kd a été calculé en ajustant les sensorgrammes à un modèle de liaison 1:1.

L'activité de PCYT2 a été dosée comme décrit précédemment avec une modification mineure57. En bref, préparer le mélange réactionnel (50 μl) dans un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), DTT 5 mM, MgCl2 10 mM, phosphoéthanolamine 650 μM et CTP avec différentes concentrations. Ensuite, le mélange réactionnel a été incubé avec 0,1 μg de PCYT2 purifié à 37 ° C pendant 3 min. Les réactions ont été terminées par ébullition pendant 2 min. La concentration du produit (pyrophosphate) a été mesurée par un kit d'analyse de pyrophosphate (Lonza, LT07-610) et la vitesse de réaction a été calculée. Du DMSO et du SB2301 ont été ajoutés à la concentration indiquée dans le mélange réactionnel.

Les images ont été analysées avec le logiciel ImageJ [National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA]. Les images d'arrière-plan du canal PCYT2 ont été obtenues à partir du flou gaussien à l'aide de Radius 8, et les images originales du canal PCYT2 ont été soustraites des images d'arrière-plan pour corriger l'arrière-plan inhomogène. Le masque LD a été préparé en ajustant le signal LD ​​selon un seuil d'intensité (Image> ajuster> seuil) en utilisant l'algorithme par défaut. Pour le masque de bord LD, Find edge (Process > Find edge) a été utilisé pour les images LD seuillées. La zone superposée entre PCYT2 dont l'arrière-plan a été corrigé et le masque LD ou le masque de bord LD a été quantifiée par le calculateur d'image (Processus> Calculateur d'image) à l'aide de l'opération ET. Les images résultantes ont été seuillées et la zone a été quantifiée par Analyser les particules (Analyser > Analyser les particules) à l'aide d'un filtre de taille de 5 à l'infini (pixel).

Les LD ont été isolés à partir de cellules HepG2 (~ 108 cellules) à l'aide de kits d'isolement LD (Cell Biolabs, MET-5011) conformément aux instructions du fabricant. La membrane, le cytosol et la fraction LD ont été collectés pour un contrôle de pureté. 1 ml de chloroforme/acétone (1:1, v/v) a été ajouté pour séparer les protéines et les lipides des LD isolées. Ensuite, la phase organique a été collectée pour une analyse plus approfondie de la composition des phospholipides. Répétez ce processus deux fois avec le culot pour dissoudre les lipides. Après avoir retiré la phase organique, le culot a été séché à température ambiante et remis en suspension avec un tampon d'échantillonnage SDS pour préparer des échantillons de protéines pour le contrôle de pureté.

Les données de diffusion dynamique de la lumière ont été obtenues avec des LD purifiées dans une cuvette en PMMA (Ratiolab, 2810100) par Malvern Zetasizer Nano-S. Le dispersant et la température ont été choisis comme eau et 25 °C, respectivement.

Pour mesurer la quantité de PE et de PC dans l'échantillon lipidique, le kit de dosage PE (Biovision, K499) et le kit de dosage PC (Biovision, K576) ont été utilisés. Les lipides extraits des lysats de cellules entières ou des LD cellulaires purifiés ont été préparés par évaporation de solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif. Selon les instructions du fabricant, des lipides séchés reconstitués avec un tampon de test PE et un tampon de test PC ont été utilisés pour mesurer chaque quantité.

Dix images de fluorescence ont été capturées en un point avec une profondeur z de 0,8 µm. Les images projetées ont été générées à l'aide du logiciel de déconvolution SoftWorks. Quinze images sélectionnées au hasard dans chaque condition ont été analysées à l'aide d'InCell Developer [GE Healthcare], et les diamètres de tous les LD présents dans l'image donnée ont été quantifiés. En supposant que la LD est une sphère parfaite, le volume de chaque gouttelette lipidique a été calculé en utilisant la relation entre le rayon et le volume (V = 4/3 πr3). Les LD ont été divisés en neuf groupes selon la longueur du rayon. La distribution de la taille des LD a été calculée en divisant la somme des volumes des LD correspondant à chaque groupe par la somme des volumes des LD totaux.

Les cellules HeLa ont été incubées avec 2 μM de BODIPY 558/568 C12 (Thermo, D3835) dans un milieu complet pendant 21 h. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du milieu complet, incubées pendant 1 h supplémentaire sans BODIPY 558/568 C12. SB2301 a été traité pendant 24 h. Pour le contrôle positif, des cellules privées de sérum (16 h) ont été préparées séparément. Les mitochondries ont été marquées avec 100 nM MitoTracker DeepRed (Thermo, M22426) et les LD ont été marquées avec 10 μM SF44 pendant 30 min simultanément avant l'imagerie par fluorescence. L'imagerie des cellules vivantes a été réalisée dans les 2 h.

Les cellules AML12 ont été ensemencées sur une plaque Agilent Seahorse XFe24 et ensuite traitées avec SB2301. Une cartouche de capteur avec Seahorse XF Calibrant (Agilent, 100840-000) a été hydratée à 37 °C pendant une nuit dans un incubateur sans CO2. L'OCR a été mesuré dans Seahorse XF DMEM (Agilent, 103757-100) contenant 17 mM de glucose (Agilent, 103577-100), 2,5 mM de glutamine (Agilent, 103579-100) et 0,5 mM de pyruvate (Agilent, 103578-100) en réponse à 1,5 μM d'oligomycine, 1 μM de fluorocarbonylcyanure de phénylhydrazone (FCCP) et 0,5 μM de roténone + antimycine A (Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit, 103015-100) avec Seahorse XFe24 [Agilent].

Le type de test statistique utilisé et le nombre de répétitions biologiques sont précisés dans la légende de chaque figure. Les chiffres de chaque expérience de chaque répétition biologique peuvent être trouvés dans les données supplémentaires 1.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les résultats de protéomique d'identification de cible (fichiers de pointe et fichiers de recherche) peuvent être trouvés dans https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22215583.v1. Les résultats de chaque réplique biologique sont fournis dans les données supplémentaires 1. D'autres données générées ou analysées dans cette étude sont fournies dans cet article ou ses fichiers d'informations supplémentaires (y compris les transferts Western non recadrés dans la Fig. 24 supplémentaire).

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Ce travail a été soutenu par la Creative Research Initiative Grant (2014R1A3A2030423) par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (ministère des Sciences et des TIC). JP et MK étaient reconnaissants pour la bourse du programme BK21 Plus.

Centre CRI de protéomique chimique, Département de chimie, Université nationale de Séoul, Séoul, 08826, Corée du Sud

Jinjoo Jung, parc Jongbeom, parc Mingi Kim et parc Seung Bum

Département de biophysique et de biologie chimique, Université nationale de Séoul, Séoul, 08826, Corée du Sud

Parc Jaeyoung Ha, Hana Cho et Seung Bum

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JJ a conçu et réalisé les expériences biologiques, analysé les données et préparé le manuscrit. JP, JH et HC ont réalisé les expériences biologiques et analysé les données. MK a conçu la méthode de synthèse et effectué la synthèse. SBP a dirigé l'ensemble de l'étude et a été impliqué dans tous les aspects de la conception expérimentale, de l'analyse des données et de la préparation du manuscrit. Tous les auteurs ont revu de manière critique le texte et les figures.

Correspondance au parc Seung Bum.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce manuscrit a déjà été évalué dans une autre revue Nature Portfolio. Le manuscrit a été jugé apte à être publié sans autre examen par Communications Biology. Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : Manuel Breuer.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Jung, J., Park, J., Kim, M. et al. La perturbation médiée par SB2301 de la composition de la membrane dans les gouttelettes lipidiques induit la lipophagie et l'ubiquitination des gouttelettes lipidiques. Commun Biol 6, 300 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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Reçu : 04 janvier 2023

Accepté : 09 mars 2023

Publié: 21 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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